辅酶Q10还原型（喹啉醇)与氧化型（醌)形式抗COVID-19活性的分子机制研究

《Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology》：Molecular insights into the anti-COVID-19 activity of reduced (quinol) and oxidized (quinone) forms of coenzyme Q10

　　

冠状病毒病2019（COVID-19）由SARS-CoV-2引起，于2020年3月被世界卫生组织宣布为全球大流行病，并迅速演变为一种全身性线粒体疾病，而非单纯的呼吸系统疾病。该疾病破坏线粒体生物能量学、氧化还原平衡和电子传递，导致醌-喹啉池的严重受损。辅酶Q₁₀（CoQ₁₀）是线粒体呼吸链的核心组分，通过其氧化型醌（CoQ；QN）和还原型喹啽（CoQH₂；QL）形式之间的动态互变，在复合物I/II与III之间传递电子。COVID-19患者表现出内源性CoQ₁₀水平降低、氧化磷酸化缺陷及过度氧化应激，这种QN-QL不平衡与炎症、血栓形成、疲劳和多器官功能障碍相关。因此，通过CoQ₁₀补充或基于QN的生物活性化合物恢复线粒体氧化还原循环，已成为一种受到关注的治疗策略。在本研究中，研究人员利用计算分析和基于人口腔鳞状细胞癌细胞（HSC3）的实验，研究了线粒体CoQ₁₀氧化还原形式对COVID-19感染关键因素的影响。分子对接分析显示，QN比QL更强地结合宿主细胞受体（雄激素受体AR、血管紧张素转换酶2 ACE2和跨膜丝氨酸蛋白酶2 TMPRSS2），这些受体是病毒感染的关键调控因子。然而，基于细胞的实验表明，两种化合物在细胞活力、克隆形成能力以及宿主细胞受体ACE2和TMPRSS2表达方面具有相似效果。此外，在暴露于氧化应激、金属应激和低氧应激的细胞中也观察到QN和QL的类似效应。较高但非较低的无毒性浓度导致两种化合物均可下调宿主细胞受体。相比之下，较低剂量的QN和QL同样保护细胞免受氧化、金属和低氧应激。这些发现表明，两种形式对在SARS-CoV-2发病机制中起作用的宿主细胞受体和应激响应通路具有相似的调节效应，支持其作为候选药物进一步研究的潜力。

本研究旨在探讨辅酶Q₁₀（CoQ₁₀）的两种氧化还原形式——还原型喹啉醇（QL）和氧化型醌（QN）——对SARS-CoV-2感染关键因素的调控作用，为开发新型抗COVID-19策略提供理论依据。论文发表于《Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology》。

**研究背景与问题**

COVID-19自2019年底爆发以来，迅速从一种急性呼吸道感染演变为全球性的重大公共卫生危机。随着研究的深入，研究人员逐渐认识到COVID-19并非单纯的呼吸系统疾病，而是一种涉及多器官损伤的全身性线粒体功能障碍性疾病。病毒感染后，机体表现出过度的炎症反应、氧化应激以及免疫系统失调，导致肺部、心血管系统等多个器官发生致命性损伤。特别是患有代谢综合征、2型糖尿病、肥胖症以及心肺基础疾病的患者，往往呈现更为严重的临床症状。

现有治疗手段存在明显局限性。虽然帕罗维德（Paxlovid，利托那韦/奈玛特韦）、瑞德西韦（Remdesivir）、莫努匹那韦（Molnupiravir）等药物已在临床使用，但高突变率和新型SARS-CoV-2变异株的不断出现使许多治疗药物失效。此外，抗病毒药物的毒性副作用、长新冠（Long COVID/ PASC，即COVID-19急性后遗症）发生率的上升，以及病毒引起的全身性功能障碍，都亟需开发新型、低毒的抗COVID药物。

线粒体功能障碍被确认为COVID-19风险因素的标志之一。病毒感染导致线粒体动力学和ATP合成通过氧化磷酸化（OXPHOS）发生病理性改变，包括辅酶Q₁₀（CoQ₁₀）的缺乏，这与慢性炎症、严重肺炎和多器官衰竭密切相关。CoQ₁₀作为线粒体电子传递链中不可或缺的电子载体，在复合物I/II与III之间传递电子，其三种氧化还原状态——完全氧化的醌型（QN，CoQ）、半醌自由基中间体（CoQH•）和完全还原的醇型（QL，CoQH₂）——的动态平衡对维持线粒体功能至关重要。COVID-19患者体内CoQ<sub>10
**主要技术方法**

研究人员采用了计算模拟与体外实验相结合的研究策略。计算方面包括：蛋白质靶点获取与制备（从蛋白质数据库PDB获取雄激素受体AR、TMPRSS2、hACE2和Mpro的结构）、基于PyRx软件的分子对接分析、以及使用Schr?dinger套件中Desmond模块进行100 ns的分子动力学（MD）模拟，并通过投稿最后50 ns计算分子力学/广义Born表面积分（MM/GBSA）结合自由能。体外实验采用人口腔鳞状细胞癌细胞系HSC3和SAS（来源于日本JCRB细胞库），通过MTT比色法检测细胞活力、克隆形成实验评估长期增殖能力、蛋白质印迹（Western blotting）和免疫荧光染色检测ACE2与TMPRSS2蛋白表达水平，并建立氧化应激（H2O2）、金属应激（Cd(NO3)2）和低氧应激（CoCl2诱导化学低氧）三种细胞模型。此外，使用Vero E6细胞（来源于ATCC的非洲绿猴肾上皮细胞）进行SARS-CoV-2（USA-WA1/2020株）抗病毒活性测定，以瑞德西韦为阳性对照。

**研究结果**

**QL和QN对HSC3细胞活力的影响**：研究人员首先比较了HSC3和SAS两种人口腔鳞状细胞癌细胞系中ACE2和TMPRSS2的表达水平，发现HSC3细胞中两种受体的表达量高出2至3倍，故选择HSC3作为后续实验模型。MTT实验结果显示，0.1至0.5 μM浓度的QL或QN处理24小时对细胞活力无明显影响；而48至72小时处理后，0.5至5 μM浓度导致细胞活力降低20%至40%。克隆形成实验证实，低于0.25 μM的浓度无显著影响，而0.5至5.0 μM浓度使克隆形成能力降低约10%。基于此，0.1至0.5 μM被确定为无毒性浓度范围，0.1和0.25 μM用于后续低剂量实验，更高浓度用于观察受体调控效应。

**宿主细胞受体表达分析**：Western blot分析显示，QL和QN以剂量依赖性方式降低ACE2和TMPRSS2表达（降低幅度10%至80%）。QL处理组在ACE2和TMPRSS2表达下降方面略强于QN处理组。免疫荧光分析进一步验证了剂量依赖性下降趋势：ACE2在≥0.25 μM浓度时显著降低，TMPRSS2在≥0.1 μM时即显著减少。这些结果表明，QL和QN具有同等能力 attenuate参与病毒感染的宿主细胞受体表达。

**与宿主细胞受体及病毒蛋白酶的分子对接**：针对雄激素受体（AR）的分子对接显示，QN的对接分数（-7.30 kcal/mol）显著高于QL（-4.64 kcal/mol），两者均与Leu704和Gln711形成氢键。100 ns分子动力学模拟表明，AR-QL和AR-QN复合物的均方根偏差（RMSD）相当（分别为2.93±0.22 ?和2.92±0.18 ?），但QN与Gln711、Met745、Phe764和Thr877四个残基的相互作用更为稳定。MM/GBSA计算显示QN对AR的结合自由能（-46.01 kcal/mol）显著高于QL（-32.44 kcal/mol）。

针对人血管紧张素转换酶2（hACE2），QL表现为弱亲和力（对接能-3.17 kcal/mol），QN略好（-4.6 kcal/mol）。QL与Glu402和Tyr515形成氢键，QN与Tyr127和Cys344相互作用。模拟过程中配体在结合口袋内有移动，MM/GBSA显示QL（-12.2 kcal/mol）和QN（-38.02 kcal/mol）对hACE2的亲和力均较弱。

针对人跨膜丝氨酸蛋白酶2（hTMPRSS2），QL和QN的对接分数相近（分别为-4.99和-5.1 kcal/mol）。QL与Ser460和Gly464形成氢键，QN则与催化三联体残基His296及Ser460、Gln438、Gln462、Gly464等存在相互作用。两者RMSD轨迹稳定且相似，Ser441催化残基与两种配体均有显著氢键作用时间。MM/GBSA显示QL结合能为-21.54 kcal/mol，QN为-35.29 kcal/mol。

针对SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro），QL对接分数较低（-3.59 kcal/mol），QN较好（-5.51 kcal/mol）。QL与Asn141和His163形成氢键，QN与Ser144、His163和Asn189相互作用。RMSD分析显示复合物稳定，但MM/GBSA显示两者结合能均较弱（QL：-17.9 kcal/mol；QN：-15.20 kcal/mol），提示对Mpro的抑制潜力有限。

**抗病毒活性评估**：基于上述实验和计算数据预测QL/QN可能具有抗病毒活性，但在Vero E6细胞上的SARS-CoV-2复制实验显示，在无毒性浓度下，QL/QN处理组与溶剂对照相比无差异，而阳性对照瑞德西韦（1 μM）可抑制>95%的病毒复制。因此，QL/QN未表现出直接的抗病毒活性。

**QL和QN对多种应激的保护作用**：研究人员建立了三种应激模型：H2O2诱导的氧化应激（IC20=25 μM）、Cd(NO3)2诱导的金属应激（IC20=1.5 μM）和CoCl2诱导的化学低氧应激（IC20=23 μM）。结果显示，经H2O2处理后，在含QL或QN（0.005或0.010 M）的培养基中恢复的肝细胞表现出更好的细胞恢复。Cd(NO3)2处理后，0.005 μM的QL/QN同样促进细胞恢复。低氧应激后，QL在0.005和0.010 M浓度、QN在0.005至0.1 μM浓度范围内均显示保护作用。这些数据表明QL和QN具有多应激减轻能力，且两种形式效果相当。

**讨论与结论**

研究人员在讨论部分系统综述了CoQ10的生物学功能及其在COVID-19中的潜在治疗价值。CoQ10作为一种兼性分子主要定位于线粒体内膜，是电子传递链和细胞能量产生的关键组分，同时具有强效抗氧化、抗炎、抗凋亡和免疫调节作用。临床研究表明，危重患者体内CoQ10水平降低，补充CoQ10或与硒、肉碱等营养素联用可支持免疫调节、缓解病毒感染期间的细胞因子驱动炎症。Moreno Fernández-Ayala等人的研究提供了线粒体功能障碍是SARS-CoV-2感染进展和严重程度关键因素的以及，65岁以上老年人内源性CoQ10水平显著下降与该人群易感性增加相关。临床试验方面，Israel等人证实CoQ10补充可显著降低COVID-19患者的住院风险；Barletta等人的前瞻性观察性研究表明，CoQ10联合α-硫辛酸可显著改善长新冠患者的疲劳严重程度和整体功能状态。

在本研究中，分子对接和动力学模拟揭示QN和QL均能与关键病毒和宿主靶点产生稳定相互作用，其中QN表现更优。特别是针对AR，QN展现出更高的对接分数和MM/GBSA结合能，与关键残基Gln711、Met745、Phe764和Thr877的稳定相互作用支持其作为调控病毒进入和宿主-病毒相互作用的先导分子潜力。然而，细胞实验显示两种化合物对细胞活力、克隆形成及ACE2/TMPRSS2受体表达具有相似效应，且均未能在Vero E6细胞中显示直接抗病毒活性。值得注意的是，低剂量QL和QN虽不改变受体表达，但能有效保护细胞对抗氧化、金属和低氧应激，这一发现提示其可能通过调控应激响应通路而非直接抗病毒途径发挥有益作用。

**研究结论**：QL和QN在HSC3细胞上表现出相似的效应，两种化合物之间无显著差异。在较低的无毒性浓度下，两者均不改变ACE2或TMPRSS2表达；而较高浓度则导致这些病毒进入受体的可比较性下调。这些结果表明，两种化合物可能对SARS-CoV-2进入所涉及的宿主细胞因素具有相似的调节作用，支持其作为抗病毒策略进一步研究的潜力。</sub>