《The AAPS Journal》：Updated Recommendations for the Bioanalysis of Antibody–Drug Conjugates (ADC) from the ADC working group of the AAPS Bioanalytical Community
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摘要：抗体-药物偶合物（Antibody–Drug Conjugate，ADC）是一类快速发展的治疗模态，将单克隆抗体的选择性靶向能力与高活性小分子载荷（payload）相结合。其固有的结构复杂性要求在从临床前发现到后期临床开发的各阶段采用精密且多维度的生物分
摘要：抗体-药物偶合物（Antibody–Drug Conjugate，ADC）是一类快速发展的治疗模态，将单克隆抗体的选择性靶向能力与高活性小分子载荷（payload）相结合。其固有的结构复杂性要求在从临床前发现到后期临床开发的各阶段采用精密且多维度的生物分析方法。本白皮书由美国药学科学家协会（American Association of Pharmaceutical Scientists，AAPS）生物分析社区ADC工作组制定，工作组成员超过100人，分别来自工业界、合同研究组织（Contract Research Organization，CRO）及监管机构，旨在提供ADC生物分析的更新建议。本工作在2013年AAPS立场文件以及近期关于ADC药代动力学（Pharmacokinetic，PK）考量的监管框架出版物基础上，阐述了总抗体（total antibody，tAb）、结合ADC（conjugated ADC）、游离（未结合）载荷及药物抗体比（Drug-to-Antibody Ratio，DAR）的生物分析定量策略进展；新型免疫原性评估考量；可溶性靶点干扰；关键试剂全生命周期管理；载荷特异性稳定性要求；交叉验证（cross-validation）策略及监管考量。本文所提出的建议反映了十余年的科学进展，旨在为当代ADC药物开发提供全面、经实证验证且与行业及监管对齐的生物分析框架。
论文解读：
《Updated Recommendations for the Bioanalysis of Antibody–Drug Conjugates (ADC) from the ADC working group of the AAPS Bioanalytical Community》一文由AAPS生物分析社区ADC工作组发表于《The AAPS Journal》。自2013年AAPS发布首份ADC生物分析立场文件以来，液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，LC–MS/MS）在蛋白类药物生物分析中的应用日趋成熟，各国监管机构也相继发布了ADC临床药理学考量指南（如FDA 2024年指南及NMPA/CDE 2025年《抗体偶联药物临床药理学研究技术指导原则》），同时行业在可溶性靶点干扰、关键试剂管理、交叉验证及高毒性载荷（如DXd）稳定性等方面积累了大量新经验。然而此前尚无系统性更新共识来指导当代ADC开发中多组分（tAb、结合ADC、游离载荷、DAR）的同步定量及方法转移。为此，AAPS ADC工作组汇聚逾百名来自工业界、CRO及监管机构的专家，经调研与研讨形成本白皮书，在继承2013年框架基础上补充上述新领域的建议，明确分阶段（发现—GLP毒理—临床）生物分析策略，对ADC药物研发具有直接的监管合规与实操指导意义。
主要关键技术方法：
研究人员采用文献综述与行业调研（survey）相结合的方式，基于AAPS ADC工作组逾100名成员的多轮讨论与共识达成，综合2013年以来已发表的方法学文献、LC–MS/MS与配体结合分析（Ligand-Binding Assay，LBA）方法学数据、监管指南要求及行业实践案例，对ADC生物分析各要素进行归纳与建议制定。无独立实验动物或临床样本队列，属专家共识白皮书。
研究结果：
【Introduction（引言）】
研究人员定义了本白皮书所用术语：ADC指通过化学连接子（linker）携带至少一分子载荷的抗体或片段；结合载荷分析法（conjugated payload assay）测定ADC上连接的载荷数量，结合抗体分析法（conjugated antibody assay）测定带载荷的抗体数量（不分载荷数）；总抗体（total antibody，tAb）含结合与未结合载荷的抗体；游离载荷（free/unconjugated payload）指未连接于抗体上的小分子药物。指出本白皮书在2013年立场文件基础上纳入了LC–MS/MS成熟应用、分阶段生物分析策略、可溶性靶点干扰、实验室间交叉验证、关键试剂生命周期管理及DXd等载荷特异性稳定性等新内容，并特别指出NMPA/CDE指南较FDA额外要求测定结合载荷及DAR随时间演变。
【Measurement of ADC and its Constituent Parts（ADC及其组成成分的测定）】
研究人员指出分析平台（LBA包括电化学发光免疫分析ECLIA和酶联免疫吸附试验ELISA，及杂交免疫捕获LC–MS/MS）的选择取决于试剂可及性、连接子类型（可裂解vs不可裂解）、通量与灵敏度。tAb可用LBA（靶抗原、抗独特型Anti-Idiotype/抗ID或抗Fc捕获）或杂交LC–MS/MS（Protein A/G、抗人Ig、靶抗原或抗ID捕获后经酶解测定特征肽段如VVSVLTVLHQDWLNGK等Fc区通用肽或可变区特异肽）。结合ADC定量分两类：结合载荷分析法（测释放/检测到的载荷，对DAR敏感）与结合抗体分析法（抗载荷抗体捕获+抗Fc/抗ID检测，不随DAR变化），LC–MS/MS因无需抗载荷抗体且具DAR敏感性而被更多采用，可在一管样本中分测tAb与ADC。游离载荷用小分子LC–MS/MS流程（蛋白沉淀PP/液液萃取LLE/固相萃取SPE）测定，须防止样品处理中ADC载荷被意外裂解。平均DAR由[结合载荷]÷[tAb]计算，可在早期开发监测连接子稳定性；个体DAR分布可用高分辨质谱（High-Resolution Mass Spectrometry，HRMS）全谱或middle-down方式测定，早期确证连接子稳定性后可酌情停止常规DAR分析。
【Immunogenicity Consideration（免疫原性考量）】
研究人员建议采用桥接法LBA多层级（筛选—确证—滴度）检测抗药抗体（Anti-Drug Antibody，ADA），可根据灵敏度、特异性及药物耐受性评估简化层级。ADC为多结构域分子，是否进一步做结构域特异性及中和抗体（Neutralizing Antibody，NAb）检测应基于免疫原性风险评估；肿瘤患者因前期化疗免疫状态多受抑，临床未见ADC免疫原性显著高于常规治疗性蛋白。
【ADC Soluble Target Consideration（ADC可溶性靶点考量）】
研究人员指出若靶抗原可显著脱落/分泌入血，FDA建议区分靶标未结合ADC与靶标结合ADC。游离靶点测定应选用与ADC亲和力相当或略低的捕获抗体，或用ADC本身作捕获以减少平衡扰动，控制稀释与孵育时间；总靶点测定需能检测游离及结合形式，必要时酸解离后检测。当ADC远高游离靶浓度时游离靶可能测不出，需依研究目的确认检测的是游离还是总靶点。
【Reagents Considerations（试剂考量）】
研究人员强调关键试剂（critical reagents）需在各阶段具备合适选择性及疾病状态无关性。早期发现可用商业化抗通用表位单抗或多抗；临床阶段需制备ADC特异性抗ID或抗载荷试剂，建议提前≥1年启动。新试剂批号需做桥接验证（bridging validation），推荐批量生产与标记、严格监控储存条件。
【Stability Considerations（稳定性考量）】
研究人员指出不可裂解连接子体内稳定性高于可裂解连接子。样品处理可致体外（ex vivo）脱共轭，受光敏性、种属酶活性、基质pH及溶血影响。以喜树碱衍生物Deruxtecan（DXd）为例，其内酯环在pH依赖下开环失活，宜低pH（<6.0）、避光（>530 nm LED影响小）、使用琥珀色或环烯烃聚合物（Cyclic Olefin Polymer，COP）管。稳定性考察可用加ADC的QC样本与不加ADC的QC对照，必要时采取超低温保存（~?70℃）、加酸/抗氧化剂或冰浴操作防脱共轭。
【Stage-specific ADC Bioanalytical Strategy（分阶段ADC生物分析策略）】
研究人员总结：发现阶段用fit-for-purpose方法测tAb、ADC、游离载荷、活性代谢物及DAR分布，异常PK时启动ADA筛查；GLP毒理阶段方法须按M10完全验证；早期临床用验证方法支持安全性与暴露表征；后期可简化——若游离载荷持续低于灵敏检测限或tAb与ADC高度相关且仅关注递送功能时可省略相应分析。平台可从通用试剂/LBA过渡至抗ID试剂/杂交LC–MS/MS，变更时需做方法可比性（comparability）评估。
【Cross Validation Strategies（交叉验证策略）】
研究人员建议PK方法跨实验室或跨平台（LC–MS/MS vs LBA）比较时，PK交叉验证应包含≥30例真实给药后样本（inculded samples）覆盖全浓度范围及不同DAR状态，含疾病基质；ADA/NAb交叉验证需比较cut point、灵敏度、药物耐受性、阳性率及滴度。方法变更或实验室转移前先做预评估，显著差异需溯源偏差原因，因多组分定量偏差会影响PK暴露-效应评价。
【ADC Bioanalysis Considerations for Regulatory Submissions（监管申报中的ADC生物分析考量）】
研究人员明确首次人体试验起核心分析物（ADC、tAb、游离载荷及药理活性代谢物）须用验证方法测定；游离载荷定量下限（Lower Limit of Quantitation，LLOQ）应根据载荷毒性、作用机制及不良反应浓度设定，高效力细胞毒素常需达10–50 pg/mL（sub-ng/mL级）。所有方法验证与研究样本分析应遵循FDA M10指南，建议申办方早期与监管机构沟通生物分析方案。
讨论与结论（翻译结论部分）：
本白皮书阐述了当前ADC开发中生物分析策略的最新观点，概述了药物抗体比（DAR）动态变化、ADC稳定性、交叉验证策略及分阶段检测的现行理解与应用。ADC生物分析的监管申报考量聚焦于美国FDA的建议及当前ADC生物分析策略实践。过去十年ADC日益广泛地被探索与应用，14个FDA批准ADC中有10个于此期间获批，更多候选分子在研且模态持续演进（包括降解剂-抗体偶联物DAC、抗体-寡核苷酸偶联物AOC、放射性标记ADC、免疫刺激抗体偶联物iSAC及单域ADC等）。这些新模态虽作用机制或结构有别，但均基于抗体精准靶向递送载荷的核心原理。生物分析学界将持续适应并发展新一代ADC及其他靶向疗法的检测表征手段；对于ADC而言，生物分析是药物开发中的战略支柱而非辅助功能。
