微升级体外气溶胶-细胞递送可吸入反义寡核苷酸 (ASO) 诱导“爆发式”药代动力学 中文标题：微升级体外气溶胶-细胞递送可吸入反义寡核苷酸 (ASO) 诱导“爆发式”药代动力学

《International Journal of Pharmaceutics: X》：Microliter-scale in vitro aerosol-cell delivery of inhalable antisense oligonucleotide (aso) induces “Burst-like” Pharmacokinetics

　　

与传统浸没式细胞培养不同，将药物雾化递送至空气-液体界面 (Air-Liquid Interface, ALI) 培养的肺细胞为可吸入药物的体外测试提供了临床相关途径。目前的雾化系统递送非生理性的大药物体积。本研究介绍了 Cloud MAX 技术，表征了其剂量测定的准确性，并将其应用于一种锁核酸修饰的反义寡核苷酸 (Locked Nucleic Acid-modified Antisense Oligonucleotide, ASO) 的毒性、疗效以及生物动力学/渗透性测试。平均而言，Cloud MAX 能将 3–20 μL 雾化液体的 44% 递送至 ALI 培养的细胞，重复给药的变异系数 (Coefficient of Variation, CV) < 11%，且可向 ALI 培养的细胞递送少至 1 μL 药物/插入物 (=0.25 μL/cm²)。作为剂量可控体外药物测试的概念验证，研究人员证明了在特发性肺纤维化 (Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF) 患者来源的原代肺成纤维细胞中，一种靶向 LIM 和钙调蛋白同源结构域 1 (LIM and Calponin Homology domain 1, LIMCH1) 的特异性 ASO 能够实现靶点结合，该成纤维细胞被 A549 肺泡上皮层所“屏蔽”，模拟了吸入治疗。即使在最低剂量 (0.64 nmol/cm²) 下，LIMCH1-ASO 在沉默 LIMCH1 方面依然有效。雾化过程既未损害 LIMCH1-ASO 的疗效，也未在最高测试剂量 (3.21 nmol/cm²) 下诱导细胞毒性。雾化 ASO 通过 A549 细胞屏障的渗透性（生物动力学）比大体积（移液）ASO 应用快 14 倍（呈“爆发式”）。计算模型揭示，这种众所周知的“爆发式”药代/生物动力学特征是由于小体积药物应用所致，而非雾化器引起的屏障紧密性（表观渗透性 P_app）改变。因此，Cloud MAX 是一个用于靶向肺治疗的可吸入药物体外药代动力学/药效学测试的物质高效平台。

**论文解读：微升级体外气溶胶-细胞递送技术用于可吸入反义寡核苷酸的药效与动力学研究**

**一、 研究背景与意义**

肺部气溶胶递送是治疗哮喘、慢性阻塞性肺疾病等慢性呼吸系统疾病局部（靶向）吸入治疗的成熟给药途径。与传统全身给药相比，吸入疗法能将药物直接递送至靶器官，提高治疗指数，减少全身副作用和代谢降解。因此，开发能够准确模拟人体吸入过程并量化细胞/组织特异性递送剂量的生理相关性体外模型，对于临床前评估药物的毒理或治疗活性至关重要。

然而，当前可吸入药物的临床前测试面临诸多挑战。首先，传统的浸没式细胞培养（细胞浸没于培养基中）无法模拟肺上皮在吸入治疗时所处的空气-液体界面 (ALI) 生理环境。ALI 条件对于促进呼吸上皮细胞的极化和分化、形成生理形态和功能（如黏液分泌）至关重要，并能避免培养基与药物的非生理性相互作用，允许气溶胶直接沉积于细胞顶侧。其次，现有的气溶胶-细胞暴露系统大多需要雾化非生理性的大体积药物（通常≥200 μL），这不仅可能导致药物浪费，对于昂贵的生物制剂（如反义寡核苷酸 ASO）而言成本高昂，也可能因药物在细胞表面形成过厚液层而影响测试的临床相关性。再者，尽管复杂的体外肺模型（如肺芯片）不断发展，但它们通常只包含少数几种肺细胞类型，难以完全模拟肺的复杂三维微环境。因此，针对特定科学问题，精心选择最相关的细胞类型构建模型，并结合生理相关的药物递送方法，是提升体外测试临床预测价值的关键。

反义寡核苷酸 (ASO) 作为一种能够靶向调控疾病相关mRNA水平的治疗策略，在肺疾病治疗中展现出巨大潜力。例如，研究显示LIM和钙调蛋白同源结构域1 (LIMCH1) 在特发性肺纤维化 (IPF) 患者的肺成纤维细胞和肌成纤维细胞中表达上调，可能成为治疗靶点。锁核酸修饰的ASO具有更高的靶标RNA亲和力与效力，且通常无需转染试剂即可在体外和体内发挥作用。然而，将ASO等生物制剂开发为可吸入药物，需要进行一系列临床前研究以评估其疗效、靶点特异性和毒性。目前，雾化给药通常在临床前阶段后期才被考虑，且基于ALI培养细胞模型的雾化药物测试在临床前药物开发中仍相对缺乏。这不仅从生物学角度（药物递送至ALI细胞模型）看是相关的，从药物化合物角度也至关重要，因为雾化过程可能损害药物的分子结构，从而影响其疗效/毒性谱。

基于上述背景，本研究旨在开发和验证一种名为 Cloud MAX 的新型气溶胶-细胞暴露技术。该技术能够实现微升级（低至3μL）液体的高效、剂量可控雾化递送，用于ALI培养细胞的体外药物测试。研究人员以靶向LIMCH1的锁核酸修饰ASO (LIMCH1-ASO) 为模型药物，在模拟肺泡屏障的共培养模型（IPF患者来源的原代肺成纤维细胞与A549肺泡上皮细胞共培养）中，系统评估了Cloud MAX技术的剂量测定准确性、递送效率，以及雾化ASO的毒性、疗效和跨上皮屏障的生物动力学特性，并深入探讨了雾化给药产生“爆发式”药代动力学特征的机制。该研究为可吸入药物，尤其是昂贵或稀缺的生物制剂，提供了一个物质高效、临床相关性更强的临床前体外测试平台。

**二、 主要技术方法**

本研究采用的核心技术方法是Cloud MAX气溶胶-细胞暴露系统。该系统核心是一个暴露歧管，包含多个垂直圆柱形暴露管，每个管底部放置一个培养有ALI细胞的6孔Transwell插入物。使用临床相关的无气流振动筛网雾化器（如Aeroneb系列）将微量液体（3-20 μL）雾化至暴露管内，形成气溶胶云，气溶胶通过重力沉降在数分钟内沉积到细胞表面。研究对Cloud MAX原型机与商用机（VITROCELL? Cloud MAX）的递送性能（沉积效率、重复性、剂量偏差）进行了系统表征，使用荧光素钠和荧光标记的Cy5-ASO作为示踪剂进行定量测定。

细胞模型方面，研究使用了多种体外模型：A549肺泡上皮样细胞单层、IPF患者来源的原代肺成纤维细胞单层、A549与IPF成纤维细胞的共培养模型，以及人肺成纤维细胞系CCD-16Lu。IPF患者来源的原代肺成纤维细胞来自CPC-M生物样本库。共培养模型用于模拟肺泡区域中上皮细胞对下层成纤维细胞的“屏蔽”效应。

主要实验包括：1) **性能表征**：评估不同雾化体积、暴露管长度下Cloud MAX的沉积效率和空间均匀性，并检测假暴露（生理盐水）对A549细胞活力、细胞毒性及炎症反应的影响。2) **毒性评估**：使用WST-1、LDH释放等实验评估不同剂量LIMCH1-ASO雾化或移液给药对单层及共培养模型的细胞毒性。3) **疗效评估**：通过分支DNA (bDNA) 检测和qRT-PCR定量LIMCH1 mRNA水平，通过蛋白质印迹法 (Western Blot) 定量LIMCH1蛋白水平，评估ASO在单层及共培养模型中的基因沉默效果。4) **生物动力学研究**：使用荧光标记的Cy5-ASO，监测其通过A549上皮单层进入基底侧培养基的转运过程，计算表观渗透系数 (P_app)，并比较雾化（小体积）与移液（大体积）给药的转运动力学差异。5) **计算建模**：建立一维扩散传输模型，模拟ASO在Transwell体系中的转运过程，以探究“爆发式”动力学的物理机制。

**三、 研究结果**

**3.1. Cloud MAX气溶胶-细胞暴露系统的描述与性能表征**
Cloud MAX系统能够实现3-20 μL液体的高效雾化递送。性能表征表明，对于7.5-20 μL的雾化体积，平均沉积效率为39% (CV=11%)；对于3-5 μL的雾化体积，平均沉积效率提高至52% (CV=8%)。系统内不同插入物之间的剂量偏差大多小于10%，显示出良好的剂量重复性与空间均匀性。假暴露实验证实，雾化过程本身（10 μL生理盐水）对ALI培养的A549细胞的活力、细胞毒性及白细胞介素8 (IL-8) 的mRNA表达均未产生显著不良影响。使用荧光标记的Cy5-ASO进行测试，其沉积效率与荧光素钠相当，表明Cloud MAX适用于ASO类药物的递送。

**3.2. 基于体外细胞的Cloud MAX介导的ASO递送与跨肺泡上皮屏障的疗效评估**
**3.2.1. LIMCH1-ASO跨肺泡上皮屏障的生物动力学**
在A549单层模型中，比较了雾化（7 μL沉积）与移液（100 μL）应用相同剂量（3 nmol）Cy5-ASO的转运动力学。结果显示，雾化ASO在15分钟内即有约75%的剂量转运至基底侧，并在1小时内达到平台期（约83%）；而移液ASO则需要2-4小时才能达到相似的转运水平。这表明雾化给药产生了快得多的“爆发式”转运动力学。计算得到的表观渗透系数 (P_app) 在两种给药方式间无统计学差异，表明上皮屏障的紧密性并未因给药方式而改变。

**3.2.2. ASO介导的LIMCH1基因敲低**
在IPF成纤维细胞单层模型中，无论是雾化还是移液给药，LIMCH1-ASO在3 nmol和15 nmol剂量下均能有效下调LIMCH1的mRNA和蛋白水平，且两种给药方式效果相似。然而，在A549与IPF成纤维细胞的共培养模型中，由于上皮细胞的“屏蔽”作用，ASO的沉默效果有所减弱。在低剂量（3 nmol）下，雾化给药的沉默效果优于移液给药；在高剂量（15 nmol）下，两种给药方式效果相当。这提示上皮屏障可能影响药物对下层靶细胞的疗效，尤其是在较低剂量时。

**四、 讨论与结论**

讨论部分深入分析了Cloud MAX技术的优势、局限性及其临床相关性。Cloud MAX凭借其高物质效率（沉积效率高达52%）、微升级给药能力、良好的剂量可控性和重复性，为可吸入药物（尤其是昂贵生物制剂）的临床前测试提供了高效平台。相较于需要大体积雾化的现有技术（如VITROCELL? Cloud），Cloud MAX显著降低了药物用量。研究也为Cloud MAX的最佳操作实践、优势和局限提供了明确指导。

关于“爆发式”生物动力学，计算模型分析揭示，其根本原因在于雾化给药时顶侧药物溶液体积小，导致初始药物浓度高，从而加速了扩散驱动的转运过程，而非雾化过程改变了上皮屏障的渗透性。这一发现对于理解吸入给药的临床药代动力学特征具有重要意义。

研究还探讨了上皮细胞对成纤维细胞药物暴露的“屏蔽”效应。在共培养模型中观察到的ASO疗效减弱，可能与上皮细胞对药物的摄取、代谢或物理屏障作用有关，这提示在开发靶向肺间质细胞的吸入药物时，需要考虑上皮屏障的影响。

在临床相关性方面，尽管Cloud MAX递送的表面剂量（μL/cm²）高于临床吸入治疗的整体肺部平均剂量，但可类比于肺部局部沉积“热点”区域的剂量。研究证实，基于ALI细胞模型和雾化给药的体外测试，能够捕捉到临床相关的“爆发式”药代动力学特征，并可用于评估上皮屏障对药物疗效的潜在影响。

**结论**部分总结道：本研究证明Cloud MAX是一种高效（效率高达52%）、剂量测定准确的微升级气溶胶-细胞递送系统，适用于中等通量的可吸入药物体外测试。其物质使用效率几乎与移液操作相当。该技术旨在模拟吸入治疗的条件，包括给药持续时间、单位肺面积沉积的液体量以及雾化过程可能诱导的机械和热应变。将雾化和小体积气溶胶沉积纳入早期临床前体外测试，可提高药物生物活性和吸收方面测试的临床准确性。本研究展示了Cloud MAX平台在临床前体外评估可吸入疗法（尤其适用于可用量有限或成本高昂的化合物）方面的实用性。此外，研究表明，即使相对简单的计算模型也能增强我们对体外药代动力学特定特征（如爆发式药物转运曲线）的机制理解。

**研究结论翻译**：本研究证明Cloud MAX是一种高效（效率高达52%）、剂量测定准确的微升级气溶胶-细胞递送系统，适用于中等通量的可吸入药物体外测试。其物质使用效率几乎与移液操作相当。该技术旨在模拟吸入治疗的条件，包括给药持续时间、单位肺面积沉积的液体量以及雾化过程可能诱导的机械和热应变。将雾化和小体积气溶胶沉积纳入早期临床前体外测试，可提高药物生物活性和吸收方面测试的临床准确性。本研究展示了Cloud MAX平台在临床前体外评估可吸入疗法（尤其适用于可用量有限或成本高昂的化合物）方面的实用性。此外，研究表明，即使相对简单的计算模型也能增强我们对体外药代动力学特定特征（如爆发式药物转运曲线）的机制理解。