仿生共递送纳米平台克服CAF与TAM诱导的免疫抑制以增强三阴性乳腺癌治疗疗效

《International Journal of Pharmaceutics: X》：Biomimetic co-delivery nanoplatform overcomes CAF- and TAM-induced immunosuppression to augment therapeutic efficacy against triple-negative breast cancer

　　

免疫检查点阻断（Immune checkpoint blockade, ICB）已成为三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer, TNBC）的基石疗法；然而，由于免疫抑制性肿瘤微环境（Tumor microenvironment, TME）的存在，其临床疗效仍不理想。TNBC的特征在于肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblasts, CAFs）的持续活化以及免疫抑制性细胞特别是肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages, TAMs）的浸润。值得注意的是，Hedgehog（Hh）信号通路在CAF活化与TAM极化中均发挥关键作用。为应对上述局限性，研究人员开发了一种红细胞膜伪装仿生共递送纳米平台，包封Vismodegib与BMS-1（命名为E-V/B@NM）。体外与体内研究表明，构建的E-V/B@NM可在肿瘤部位显著富集，并对酸性TME作出响应而实现可控药物释放。治疗药物有效抑制Hh通路活化，进而抑制CAFs分泌细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）成分，并将M2样TAMs重极化为免疫刺激性M1表型。与PD-1/PD-L1抑制协同作用，该策略显著增强树突状细胞（Dendritic cells, DCs）的成熟与抗原呈递功能，促进CD8⁺ T细胞浸润及免疫应答，有效抑制TNBC小鼠模型中原发肿瘤进展与转移。研究结果表明，基于E-V/B@NM的仿生纳米平台通过重编程CAFs与TAMs重塑TME，从而克服免疫抑制并提高TNBC中ICB的疗效。

免疫治疗是三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer, TNBC）的重要治疗手段。靶向PD-1/PD-L1的免疫检查点阻断（Immune checkpoint blockade, ICB）联合化疗已获批用于晚期或高危早期TNBC，显著改善了部分患者尤其是PD-L1阳性肿瘤患者的生存结局。然而，ICB在TNBC中的疗效仍然有限，客观缓解率仅为20%-40%（Dvir et al., 2024）。限制ICB在TNBC中疗效的一个关键因素是免疫抑制性肿瘤微环境（Tumor microenvironment, TME）。部分TNBC病例被归类为"免疫排斥"亚型，其特征为细胞毒性T细胞浸润 minimal 且免疫活化不良。此外，TNBC中的TME富含免疫抑制性细胞，如肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages, TAMs），后者进一步抑制抗肿瘤免疫并促进免疫逃逸（Kundu et al., 2024; Xu et al., 2024）。鉴于这些挑战，亟需探索更优化的联合免疫治疗策略以提高TNBC的治疗疗效。

TNBC中TME的一个显著特征是高密度纤维化基质的存在，通常以过度活化的肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblasts, CAFs）和过度的细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）沉积为特征（Ding et al., 2022）。这种致密基质增加实体应力、升高组织间液压力并压迫血管，形成一系列阻碍细胞毒性T细胞穿透肿瘤实质的病理屏障，这是导致肿瘤免疫排斥的现象之一（Chen et al., 2019; Xiao et al., 2023）。多种信号通路包括Hedgehog（Hh）信号通路均与CAF活化及ECM产生相关（Walter et al., 2010; Fang et al., 2023）。肿瘤细胞过度分泌Hh配体（如音猬因子Sonic Hedgehog, Shh），通过旁分泌信号激活相邻成纤维细胞中的Hh通路，驱动静息成纤维细胞向CAF表型分化。 D一这些活化的CAF在Hh信号诱导下分泌细胞因子、生长因子和ECM修饰蛋白，从而促进肿瘤免疫逃逸（Zhang et al., 2021; Giammona et al., 2023）。此外，肿瘤或基质细胞分泌的Hh配体可通过旁分泌或自分泌方式激活巨噬细胞上的Hh受体，直接诱导M2极化相关基因表达（Petty et al., 2019）。Hh通路还通过调节细胞因子分泌和代谢重编程驱动TAMs向促肿瘤M2样表型转变，从而支持免疫逃逸和TME重塑（Wang et al., 2023）。因此，抑制Hh通路可能通过抑制CAFs的促肿瘤功能和逆转TAM极化来增强抗肿瘤免疫。

尽管联合免疫治疗增强抗肿瘤疗效，但其可能同时增加免疫相关不良事件和累积毒性的风险。基于纳米载体的药物递送平台不仅能改善难溶性药物的生物利用度并控制释放动力学以延长治疗效果，还能实现精准靶向递送以减少对健康组织的脱靶毒性（Jain et al., 2018; Peng et al., 2023）。然而，传统合成纳米颗粒常被免疫系统过早清除，导致治疗效果不佳。为应对这一局限性，研究人员开发了细胞膜伪装仿生递送纳米颗粒，通过天然细胞膜工程化纳米载体，赋予其增强的生物相容性、免疫逃逸能力和延长循环时间（Xu et al., 2022; Han et al., 2024; Gu et al., 2021）。重要的是，基于联合免疫治疗策略的仿生纳米递送系统已在提高肿瘤治疗疗效方面显示出显著改善（Xiong et al., 2021; Chen et al., 2024）。基于此，研究人员开发了一种包封Vismodegib和BMS-1的红细胞膜伪装共递送纳米平台，用于TNBC的抗基质免疫治疗。该联合治疗不仅通过Hh通路抑制减弱CAFs的异常活化并促进TAMs向抗肿瘤M1表型的重极化，还协同重塑免疫抑制性TME。这种双重方法有效逆转细胞毒性CD8⁺ T细胞的肿瘤免疫排斥，并增强对难治性TNBC的ICB疗效。研究结果表明，所开发的纳米药物作为改善TNBC免疫治疗结局的有望策略具有潜在的临床价值。

主要关键技术方法包括：采用改良自组装溶剂蒸发法制备纳米胶束，结合低渗肿胀和脂质体挤出技术制备红细胞膜囊泡，通过共挤出实现仿生纳米平台组装；利用透射电子显微镜（Transmission electron microscopy, TEM）和动态光散射（Dynamic light scattering, DLS）进行粒径与形态表征；高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography, HPLC）测定包封率和载药量；体外透析法评价pH触发释药特性；建立4T1原位TNBC小鼠模型的活体成像系统（IVIS Spectrum）分析体内分布；流式细胞术分析免疫细胞亚群；酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测细胞因子和ECM成分；多重免疫组织化学（Multiplex immunohistochemistry, mIHC）和常规免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）分析组织蛋白表达。

**纳米平台表征与pH响应释药**

研究人员采用改良自组装溶剂蒸发法制备V/B@NM纳米胶束，再通过红细胞膜囊泡与纳米胶束共挤出，成功构建红细胞膜伪装仿生共递送纳米平台E-V/B@NM。TEM显示V/B@NM和E-V/B@NM均呈球形，直径分别为132.5 ± 5.4 nm和157.2 ± 4.9 nm，E-V/B@NM表面可见约20 nm厚度的均匀红细胞膜包覆层。DLS测得水合动力学直径分别为149.1 ± 5.1 nm和183.3 ± 4.4 nm，红细胞膜包覆后zeta电位由?2.23 ± 0.14 mV转变至?22.71 ± 0.14 mV。Western blot证实E-V/B@NM中存在红细胞膜特异性蛋白CD47。HPLC定量分析显示，Vismodegib和BMS-1的载药量分别为4.25 ± 0.35%和4.57 ± 0.28%，包封率分别为78.38 ± 1.89%和82.51 ± 2.04%。17天稳定性监测显示粒径和多分散指数无显著变化。释药实验表明，pH 7.4条件下48 h累积释药率低于23%，而pH 5.0时Vismodegib和BMS-1的48 h累积释放率分别达81.6%和91.1%，呈现明显的pH触发释药特性。

**抑制CAF介导的ECM分泌并逆转M2样巨噬细胞极化**

细胞毒性实验显示，E-V/B@NM在药物浓度低于5 μg/mL时细胞活力大于95%，故选取5 μg/mL用于后续实验。免疫荧光显示，Shh诱导的NIH/3T3细胞中Smo、Gli1和α-SMA表达显著升高，证实5 ng/mL Shh配体有效诱导CAF活化；E-V/B@NM(pH 6.5)组上述蛋白水平显著下调，归因于酸性条件下Vismodegib的增强释放。ELISA验证E-V/B@NM显著抑制Shh诱导的胶原I、纤连蛋白和透明质酸等ECM蛋白过度产生。20 ng/mL Shh处理24 h使M0-BMDMs向M2表型极化，F4/80⁺CD206⁺巨噬细胞比例由75.1 ± 2.0%升至98.9 ± 0.2%；Vismodegib显著减少M2样巨噬细胞群体，E-V/B@NM(pH 6.5)将M2样巨噬细胞比例降至80.0 ± 1.0%，F4/80⁺CD86⁺巨噬细胞增至5.7 ± 0.2%。ELISA证实E-V/B@NM(pH 6.5)显著下调TGF-β1和IL-10表达，同时上调TNF-α和IL-12表达。结果表明E-V/B@NM通过拮抗Hh信号通路有效抑制CAF活化、减少ECM分泌能力，并促进巨噬细胞由M2向M1表型重极化。

**增强原位TNBC模型中的肿瘤靶向分布**

IVIS成像追踪E-V/B@NM体内分布。游离Cy7染料因快速扩散清除而无肿瘤荧光增强；纳米载体通过增强渗透和滞留效应选择性富集于实体瘤。与V/B@NM相比，E-V/B@NM在荷瘤小鼠中肿瘤蓄积显著增强，且随时间推移肿瘤偏好性更加明显。离体成像显示V/B@NM组心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织Cy7荧光强度较高，而E-V/B@NM组肿瘤组织荧光更强、其他器官信号显著降低。结果表明E-V/B@NM通过继承红细胞表面蛋白，展现出增强的生物相容性、减少的免疫清除和改善的肿瘤靶向递送效率。

**联合免疫治疗增强疗效并确保生物安全性**

生存研究显示，第45天存活率自0%（生理盐水、Vismodegib、BMS-1）升至70%（E-V/B@NM），第54天仅E-V/B@NM组维持40%存活，显著延长荷瘤小鼠生存时间。肿瘤生长曲线显示E-V/B@NM联合治疗显著抑制肿瘤生长并使后期肿瘤停滞，肿瘤抑制率达71.4 ± 4.3%，显著高于E-V@NM（36.4 ± 3.6%）和E-B@NM（43.8 ± 2.2%）。组织病理学显示治疗组细胞皱缩、空泡化和染色质边集，E-V/B@NM组最为明显。IHC评估显示E-V/B@NM最有效地抑制Ki-67和CD31表达，表明对肿瘤细胞增殖和血管生成的强效抑制。

转移负荷分析显示，生理盐水组肺转移结节数为17.3 ± 3.2个（直径≥1 mm），E-V@NM、E-B@NM和E-V/B@NM分别降至6.8 ± 2.2、5.8 ± 2.3和2.4 ± 1.6个。肺和肝脏H&E染色显示模型动物广泛转移灶，各治疗均减少转移灶数量和大小，E-V/B@NM抗转移效果最显著。

生物安全性方面，E-V/B@NM溶血率显著低于V/B@NM，表明红细胞膜修饰赋予其优异血液相容性。E-V/B@NM组小鼠早期体重持续增加、后期保持稳定。心、脾、肾组织病理学分析未见显著病理损伤。全血细胞计数及肝肾功能指标（ALT、AST、CRE、BUN）与生理盐水组相比无显著差异，证实仿生纳米药物具有良好体内生物安全性。

**克服CAF和TAM介导的免疫抑制以增强CD8⁺ T细胞浸润和抗肿瘤免疫**

Masson染色和天狼星红染色显示生理盐水组胶原纤维含量高、ECM纤维化显著，E-V/B@NM最显著降低胶原含量。mIHC分析显示生理盐水组α-SMA和胶原I高表达而CD8α低表达，表明CAF来源的ECM成分形成致密基质屏障限制CD8⁺ T细胞浸润导致免疫排斥。E-V/B@NM联合治疗阻断Hh通路破坏肿瘤细胞-CAF互作，抑制α-SMA⁺ CAF活化、降低胶原I表达；BMS-1下调肿瘤细胞和基质细胞（CAFs和TAMs）PD-L1表达，逆转协同建立的免疫抑制性TME以促进CD8⁺ T细胞瘤内浸润。流式细胞术显示E-V/B@NM显著增加肿瘤中成熟DCs和CD8⁺ T细胞浸润，CD8⁺ T细胞分别较生理盐水组、E-V@NM组和E-B@NM组增加约18.3%、9.7%和12.5%。E-V/B@NM显著减少M2-TAMs浸润（较生理盐水组降低约12.2%），并显著促进TAMs向M1极化（较生理盐水组增加约15.7%）。ELISA分析显示E-V/B@NM显著下调免疫抑制性细胞因子（IL-6、CXCL12、TGF-β1和IL-10）并上调免疫刺激性细胞因子（CXCL10和IFN-γ）。IHC显示E-V/B@NM最显著上调MHC-I/II表达。

研究讨论部分系统阐述了E-V/B@NM的作用机制与临床意义。CAFs和TAMs作为TME中主要的免疫抑制性细胞群体，通过复杂细胞间通讯建立正反馈环路共同抑制抗肿瘤免疫。肿瘤细胞来源的Shh配体异常激活相邻成纤维细胞中的Hh信号通路，促进其向CAFs转化并增强ECM重塑能力。Hh通路通过直接激活巨噬细胞中Gli依赖性转录和间接重塑TME驱动TAMs向M2极化，而Hh通路抑制剂（如Vismodegib）可逆转这一M2极化过程。本研究开发的酸响应性红细胞膜伪装纳米药物通过CD47-SIRPα相互作用有效抑制免疫清除、显著延长纳米颗粒系统循环时间，其低免疫原性减少肝脾蓄积并改善肿瘤靶向蓄积和药物释放。

致密ECM沉积形成的纤维化TME通过物理屏障形成、分泌免疫调节分子等多维度机制建立深度免疫抑制微环境。研究证实生理盐水组肿瘤组织中α-SMA与CD8α表达呈负相关，表明myCAFs形成的致密基质结构抑制CD8⁺ T细胞浸润。E-V/B@NM重塑ECM形成更松散结构，促进CD8⁺ T细胞浸润。与Steele等关于胰腺癌研究的 apparent 矛盾可能归因于肿瘤背景和治疗时程差异，以及Vismodegib与BMS-1联合治疗对免疫抑制性TME重塑的协同效应。

E-V/B@NM联合治疗有效重极化M2型TAMs为M1样表型的机制涉及两个方面：Vismodegib通过拮抗Hh信号通路抑制M2样巨噬细胞极化，BMS-1通过阻断巨噬细胞中PD-1信号直接抑制M2极化，并可能通过恢复T细胞功能促进IFN-γ分泌间接促进M1极化。该联合治疗有效抑制IL-6、CXCL12、TGF-β1和IL-10等关键免疫抑制性细胞因子的级联放大，破坏CAFs与TAMs之间的正反馈环路。此外，E-V/B@NM下调肿瘤细胞和基质细胞（CAFs和TAMs）中PD-L1表达，逆转这些细胞协同建立的免疫抑制性TME，促进CD8⁺ T细胞瘤内浸润。联合治疗上调肿瘤组织中MHC-I/II表达，除Hh通路抑制减少活化CAFs分泌免疫抑制性细胞因子、缓解其对肿瘤MHC表达的抑制作用外，PD-1/PD-L1阻断导致CD8⁺ T细胞活化分泌IFN-γ，可直接诱导肿瘤细胞和抗原呈递细胞中MHC-I/II上调。与E-B@NM单药治疗相比，E-V/B@NM联合治疗通过成功激活TME内CD8⁺ T细胞，在难治性TNBC中诱导更强的治疗反应，启动自我维持且渐进增强的抗肿瘤免疫循环。

研究结论：该研究成功开发了一种红细胞膜伪装仿生纳米药物E-V/B@NM，其具有pH响应性药物释放、优异生物相容性、肿瘤靶向能力和生物安全性。体外实验揭示E-V/B@NM介导的Hh通路抑制不仅抑制CAF活化、减少ECM成分分泌，还促进TAMs由促肿瘤M2表型向抗肿瘤M1表型重极化。体内研究表明E-V/B@NM联合治疗显著抑制小鼠原位肿瘤生长及肺/肝转移灶形成，疗效优于单药治疗（E-V@NM或E-B@NM），肿瘤生长抑制率和转移抑制率分别达约71.4%和88.2%。增强的治疗疗效归因于Vismodegib/BMS-1组合对基质-肿瘤相互作用的协同阻断，其克服CAF和TAM介导的免疫抑制、重编程免疫抑制性TME、促进DCs成熟和抗原呈递功能，从而增强CD8⁺ T细胞肿瘤浸润和抗肿瘤免疫应答。该研究为TNBC的临床管理提供了新颖的治疗策略。