糖酵解基因PFKP突变所致可预防的先天性心脏畸形综合征

《JACC: Basic to Translational Science》：A Preventable Congenital Heart Malformation Syndrome Caused by a Mutation in the Glycolytic Gene PFKP

　　

摘要：本研究报道一种由糖酵解基因PFKP（血小板型磷酸果糖激酶-1，platelet isoform of phosphofructokinase-1）错义杂合突变（R755W）引起的以心室壁变薄及室间隔缺损为特征的先天性心脏病。其致病机制为PFKP突变导致酶活性受损，抑制心肌细胞增殖，引起致密心肌层变薄。在小鼠模型中，研究人员发现给予下游代谢物果糖-1,6-二磷酸（fructose-1,6-bisphosphate，F-1,6-BP）可逆转胎鼠心肌发育不全，为宫内干预提供了概念验证。临床上，研究人员通过植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）成功阻断该致病突变的垂直传递，获得健康婴儿。

论文解读：《A Preventable Congenital Heart Malformation Syndrome Caused by a Mutation in the Glycolytic Gene PFKP》

【研究背景与意义】

先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）是全球出生缺陷致死的首要原因，但大多数病例的遗传缺陷与致病机制尚未明确，制约了有效防治策略的开发。胚胎期心脏发育依赖心肌细胞大量增殖形成心肌层，此过程对能量和生物合成前体需求巨大；子宫内生理性低氧环境下，发育中心脏主要通过糖酵解（glycolysis）供能并提供核酸、脂质等大分子合成原料，因此糖酵解关键基因功能缺陷或母体代谢紊乱可能是胎儿心脏病潜在病因。磷酸果糖激酶-1（phosphofructokinase-1，PFK1）是糖酵解关键限速酶，血小板型同工酶PFKP（PFK-platelet isoform，PFKP）在胚胎心脏尤其心肌细胞中特异性高表达，但其突变与人类遗传性疾病此前未见报道。本研究由Siyao Zhang、Hairui Sun等来自首都医科大学附属北京安贞医院胎儿心脏病母胎医学中心的研究人员开展，旨在鉴定新发CHD致病基因并探索干预策略，论文发表于《JACC: Basic to Translational Science》。

【主要关键技术方法】

研究人员纳入两家系常染色体显性遗传、表型为心室致密部变薄伴室间隔缺损的CHD家系，采集外周血/组织进行全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）并结合连锁分析筛选共分离变异；利用CRISPR/Cas9构建同源Pfkp R754W（人R755W对应位点）敲入小鼠模型，从患者及健康家属获取人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）并分化为心肌细胞（hiPSC-CMs），通过基因编辑校正突变建立等基因对照；采用Western blot检测蛋白表达，PFK1酶活性测定及Seahorse细胞外酸化率（extracellular acidification rate，ECAR）评估糖酵解通量，组织学及Ki67免疫荧光/流式评估心肌形态与增殖；通过羊膜腔内注射果糖-1,6-二磷酸（fructose-1,6-bisphosphate，F-1,6-BP）行体内挽救实验；临床对携带突变家系实施植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）结合辅助生殖筛选不携带突变胚胎移植。

【研究结果】

PFKP R755 W突变与常染色体显性遗传的心室致密部变薄及室间隔缺损共分离

研究人员对家系1的12名成员行WGS，排除已知CHD/心肌病基因致病突变后，连锁分析将致病区间定位于10p15.3-p15.1（5.8 Mb，LOD=2.4），全基因组共分离分析发现唯一罕见蛋白改变变异——PFKP NM_002627.4:c.2263C>T（p.R755W），该变异在gnomAD中极罕见（等位基因频率1.859×10??），R755位于PFKP四聚体亚基界面且高度保守，多种算法预测有害；在中国胎儿CHD数据库1650个家系的筛查中于独立家系2发现相同突变及相似表型，确认PFKP R755W为致病突变。

PFKP在人胎儿心脏心肌细胞中富集表达

基于公共bulk RNA-seq及单细胞转录组数据并结合本人胎儿心脏组织与hiPSC-CM验证，PFKP在胚胎期心脏表达量高于其他器官，且在心肌细胞中特异性高表达，为其突变导致心脏特异性表型提供生物学基础。

PFKP R755 W突变在细胞和动物模型中重现心肌发育不全及细胞增殖缺陷

患者来源PFKP^R755W/+hiPSC-CMs较野生型（WT）及突变校正（PFKP^Correct/+）对照组心肌细胞增殖（Ki67阳性率）显著降低；Pfkp^R754W/R754W纯合小鼠胚胎E15.5及E17.5出现与人相似的明显心室壁变薄及心肌细胞增殖下降，而杂合小鼠无明显结构异常，纯合小鼠可用于机制研究。

基因校正恢复PFKP R755 W突变导致的PFK1活性与糖酵解缺陷

PFKP蛋白表达在突变hiPSC-CMs及纯合小鼠心脏中与WT无差异；PFK1总酶活性及基础糖酵解、最大糖酵解能力在突变细胞中显著下降，经CRISPR校正后完全恢复至WT水平，证实R755W损害酶催化功能而非蛋白稳定性。

下游代谢物果糖-1,6-二磷酸（F-1,6-BP）补充挽救PFKP R755 W变异所致表型

体外给予5 mM F-1,6-BP可使突变hiPSC-CMs增殖恢复至对照水平；E12.5纯合小鼠胚胎单次羊膜腔内注射F-1,6-BP至E17.5可显著改善心室壁厚度并恢复心肌细胞增殖，证明绕过酶学阻滞的代谢补救策略可行。

植入前遗传学检测联合辅助生殖成功阻止疾病代际传递

研究人员将PFKP R755W判定为致病突变（ACMG标准），对家系1行PGT筛选不携带突变胚胎移植，获健康新生儿，产后超声心动图证实心脏结构与功能正常，实现该单基因严重CHD的垂直传递阻断。

【讨论与结论翻译】

本研究首次报道由糖酵解基因PFKP突变导致以心肌发育不全为核心表型的先天性心脏畸形综合征。PFKP调控胚胎期胎儿心脏主要能源——无氧糖酵解，该综合征主要表型包括心室致密心肌变薄、室壁运动减弱、不同程度心功能受损，常伴间隔缺损及传导束阻滞。研究首次建立代谢相关基因PFKP缺陷与胚胎心脏发育异常的联系，阐明"基因变异→代谢功能障碍→细胞增殖缺陷→结构性心脏缺陷"的致病链。更重要的是，研究人员通过在动物模型中补充下游代谢物挽救心脏发育缺陷表型，不仅确立PFKP为心脏发育新致病基因，也为此类先天性心脏畸形综合征的宫内代谢干预策略探索提供理论与概念验证。传统PFK1另两个同工酶PFKM和PFKL缺陷主要表现为出生后代谢病，而PFKP作为增殖心肌细胞中主导PFK1同工酶，在其特定的"发育窗口期"功能缺失特异地抑制心肌细胞增殖致心肌壁变薄，并可继发房/室间隔闭合失败形成永久性结构缺陷。R755位于PFKP四聚体亚基界面，精氨酸被色氨酸取代破坏亚基间相互作用、影响四聚体组装致催化活性丧失。人常染色体显性遗传与小鼠纯合才显现表型之种属差异常见于CHD建模，可能与物种基因剂量敏感性及表观缓冲能力不同有关。F-1,6-BP补救实验表明PFKP介导糖酵解流受阻是心肌发育不全的主要驱动因素。临床提示PFKP应纳入以心肌壁变薄合并间隔缺损为特征的CHD基因检测Panel；宫内代谢物补充干预为源于糖酵解共同通路的心血管发育缺陷治疗/预防提供了可检验靶点。局限性包括：宫内干预时机为E12.5属"宫内治疗"非严格"预防"；人家系表型变异度大的修饰因素未明；基因校正证必要性但未在此体系中单独证充分性（两独立家系相同突变及纯合小鼠表型强支持原发性）；PFKP突变在更广泛CHD人群中的携带率待大样本验证。

结论：本研究确立PFKP为关键心脏发育基因，其功能性缺陷是由糖酵解能量代谢异常驱动、以心肌发育不全为核心表型的先天性心脏畸形综合征的重要致病因素；该发现为临床诊断、宫内干预及孕前预防提供了新靶点与依据，并揭示了基础代谢在关键时间窗调控人类器官形成的核心机制。