朝鲜冷杉(Abies koreana E.H.Wilson)新害虫日本艾蚜(Mindarus japonicus Takahashi)的鉴定及韦氏芽孢杆菌(Bacillus velezensis) CE 100对其生物防治研究

《Entomological Research》：Identification and Biocontrol of Mindarus japonicus Takahashi, a New Pest of Abies koreana E.H.Wilson Using Bacillus velezensisCE 100

　　

摘要：高山松树如朝鲜冷杉(Abies koreana E.H.Wilson，韩国冷杉)具有重要的生态作用，但因气候变化导致害虫高发而日益濒危。本研究首次鉴定了危害朝鲜冷杉新发针叶与嫩枝、引起卷叶、群集及生长受阻的一种 notorious 蚜虫害虫。基于线粒体条形码区(mitochondrial barcode region)的形态学特征与分子分析，确定该害虫为日本艾蚜(Mindarus japonicus Takahashi)。由于森林环境限制化学农药使用，研究人员探讨了韦氏芽孢杆菌(Bacillus velezensis) CE 100 作为防治日本艾蚜的潜在生物防治策略。B. velezensis CE 100 在生长过程中产生表皮降解酶——脂肪酶(lipase)、蛋白酶(protease)和几丁质酶(chitinase)，发酵液峰值活性分别为 148.74、45.12 和 77.08 units/mL。用 B. velezensis CE 100 发酵液处理 48 h 后蚜虫死亡率为 75.00%。粗酶组分中脂肪酶、蛋白酶和几丁质酶比活力分别为 9398.66、716.21 和 508.00 units/mg protein，致蚜虫死亡率达 87.50%。扫描电镜(SEM)与透射电镜(TEM)超微结构分析显示，两种处理均造成上表皮广泛损伤，包括开裂、孔隙形成、内表皮层塌陷及取向紊乱。研究结果表明，应用 B. velezensis CE 100 作为日本艾蚜（朝鲜冷杉上新鉴定害虫）的防治手段具有前景，可作为一种环境友好型策略以促进亚高山针叶树保护。

研究背景与意义：

朝鲜冷杉(Abies koreana E.H.Wilson)是分布于海拔1000 m以上亚高山地区的代表性常绿针叶树种，在调节积雪与土壤水分、防止侵蚀与滑坡、参与碳循环及维持生物多样性方面具重要生态价值。受全球气候变暖影响，亚高山树种面临环境胁迫并更易遭受虫害侵袭，加之昆虫适生范围扩大，使朝鲜冷杉种群衰退并被IUCN列为濒危物种。以往未见日本艾蚜(Mindarus japonicus Takahashi，半翅目：蚜科 Aphididae)危害朝鲜冷杉的记载，其典型症状为新梢针叶卷曲、群集及生长受抑。传统化学杀虫剂在森林环境中残留污染重且伤害非靶标生物，而天敌昆虫受环境因子限制效果不稳定；苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)需昆虫取食起效，对刺吸式蚜虫效果差。近年研究发现产表皮降解酶（脂肪酶、蛋白酶、几丁质酶）的昆虫病原细菌可通过直接降解昆虫外骨骼发挥杀虫作用，无需被取食，适用于半翅目害虫。本研究由韩国国立山林科学院(National Institute of Forest Science, NIFoS)等资助，发表于《Entomological Research》，首次确认日本艾蚜为朝鲜冷杉新害虫，并评估韦氏芽孢杆菌(Bacillus velezensis) CE 100 及其所产表皮降解酶对该蚜虫的生物防治潜力，为亚高山针叶林生态友好型害虫管理提供依据。

主要关键技术方法：

研究人员于2022年从韩国光州全南大学实验林朝鲜冷杉受害植株上采集蚜虫标本。采用形态学观察结合线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因条形码PCR扩增与测序，通过NCBI BLAST比对及MEGA 11最大似然法(Maximum Likelihood, ML)构建系统发育树进行种类鉴定。将分离自番茄盆栽土壤的B. velezensis CE 100 接种于粉红肉汤(Pink Broth, PB)培养基30℃振荡培养，逐日取上清测定脂肪酶(lipase)、蛋白酶(protease)与几丁质酶(chitinase)活性，并以硫酸铵沉淀法从6 d培养物中提取粗酶组分并测定总蛋白及比活力。选用日本艾蚜若虫设对照组(无菌蒸馏水)、PB培养基对照、6 d菌发酵液及粗酶液4个处理组，喷施后每12 h记录死亡数并按Abbott公式校正死亡率(n=3)。死虫经戊二醛固定、梯度乙醇脱水后分别进行扫描电镜(SEM)与透射电镜(TEM)制样观察表皮超微结构变化。数据经IBM SPSS 25进行单因素方差分析(ANOVA)及LSD多重比较(p<0.05)。

研究结果：

3.1 Identification of Aphid Pest（害虫种类鉴定）

通过对采集蚜虫进行形态学观察——若虫体长1.5–2.0 mm，梨形腹部、浅绿色覆白色蜡质，具五节触角与刺吸式口器；有翅型体长2.0–2.5 mm，头胸深绿、腹浅绿具六条黑横纹——与文献记载及韩国山林厅数据库比对符合M. japonicus特征。COI条形码序列经NCBI BLAST显示与已登录M. japonicus相似度94.44%–94.60%，系统发育树中与韩国分离株(GenBank: GU978807)聚为一支且相似度99%。综合形态、寄主危害症状及分子证据，确定该害虫为日本艾蚜(Mindarus japonicus Takahashi)，系首次记录危害A. koreana。

3.2 Cuticle-Degrading Enzyme Activity（表皮降解酶活性）

B. velezensis CE 100 在PB培养基中随时间动态产酶：脂肪酶第4 d达峰148.74 units/mL后略降；蛋白酶第7 d达峰45.12 units/mL；几丁质酶第6 d达峰77.08 units/mL。自6 d发酵液提取的粗酶组分中脂肪酶、蛋白酶、几丁质酶体积活力分别为1569.58、119.61、84.84 units/mL，对应比活力为9398.66、716.21、508.00 units/mg protein，表明该菌株具备持续分泌三种表皮降解酶的能力。

3.3 Aphicidal Activity Against M. japonicus（对日本艾蚜的杀虫活性）

处理12 h时菌发酵液与粗酶液组蚜虫死亡率分别为26.67%与50.00%，PB对照组无死亡；处理48 h时粗酶组分与菌发酵液校正死亡率分别为87.50%与75.00%，显著高于PB对照(p<0.05)。粗酶组分因酶浓度更高致死率优于发酵原液，证实表皮降解酶是主要杀虫因子。

3.4 Cuticle Ultrastructure Analysis（表皮超微结构分析）

SEM观察：对照与PB处理组蚜虫表皮完整、刚毛正常；B. velezensis CE 100 发酵液及粗酶处理组表皮出现孔洞、裂纹、刚毛脱落及撕裂。TEM观察：对照与PB组表皮分层清晰、致密层与疏松层界限明确；处理组内部表皮层出现不规则空隙、层状结构松弛、取向紊乱，表明上表皮脂质/蛋白层及几丁质-蛋白交联被水解破坏。

讨论与结论翻译：

本研究表明M. japonicus首次被记录为朝鲜冷杉森林与人工林害虫，其若虫取食新叶汁液致叶变形并分泌蜜露引发针叶聚集。B. velezensis CE 100可产生脂肪酶、蛋白酶和几丁质酶，分别降解昆虫表皮的蜡质层脂质、上表皮蛋白及原表皮几丁质-蛋白复合物，菌发酵液与粗酶处理48 h内对日本艾蚜最高致死率分别达75.00%和87.50%。SEM与TEM结果显示处理组蚜虫外表皮开裂、穿孔，内表皮层崩解、片层紊乱，证实杀虫机制为细菌表皮降解酶协同破坏蚜虫外骨骼完整性导致失水与环境胁迫致死，其中脂肪酶先降解蜡质层促进蛋白酶与几丁质酶向内渗透发挥协同效应。粗酶组分因酶富集度更高表现出更强杀虫效力。此为首次报道M. japonicus危害A. koreana及B. velezensis CE 100对其生物防治潜力，结果为亚高山针叶树易受虫害的生态友好型治理与保护提供了基础依据。