小鼠中长期抗原降低未能实现持久的乙型肝炎病毒控制但增强了治疗性疫苗的疗效

《JFO Open Ophthalmology》：Long-term antigen reduction does not achieve durable HBV control in mice but enhances therapeutic vaccine efficacy

　　

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染导致的死亡人数持续上升，但尚无根治性疗法。本研究旨在确定利用RNA干扰（RNAi）长期抑制病毒抗原是否能够恢复HBV特异性免疫并实现持久的病毒控制，以及HBV抗原需要被抑制多长时间才能使治疗性疫苗接种恢复免疫力。研究人员使用针对所有HBV转录本的肝脏导向性小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）对HBV转基因或腺相关病毒（AAV）-HBV感染的HBV携带小鼠进行长达七个月的治疗。评估了抗病毒效果以及B细胞和T细胞免疫的发展。一部分小鼠在接受siRNA治疗终止前接受了异源初免/加强治疗性疫苗TherVacB。连续siRNA治疗使乙型肝炎表面抗原（HBsAg）降低多达4 log₁₀，但在12-16周后观察到阈值效应。长达7个月的病毒抗原抑制未导致T细胞免疫的自发重建；这需要治疗性疫苗的刺激来诱导。在没有疫苗接种的情况下，即使发生了HBsAg和乙型肝炎e抗原（HBeAg）血清学转换，停止siRNA治疗后HBV复制仍然反弹。然而，更长时间的siRNA预处理与肝脏中I型干扰素（IFN-I）信号的增加相关。8周而非3.5周的siRNA预处理改善了治疗性疫苗激活功能性抗病毒T细胞、完全控制HBV复制以及显著减少HBV阳性肝细胞数量的能力（p<0.01至p<0.001）。研究数据表明，除抑制病毒抗原外，免疫刺激对于实现治疗停止后的持久HBV控制也是必要的。这些结果将有助于设计能够最终实现HBV控制的临床试验。

## 研究背景与问题

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球重大公共卫生问题，据世界卫生组织（WHO）估计，2022年约有2.54亿人慢性感染HBV，110万人死于其相关后果。目前标准治疗方案——核苷（酸）类似物（NUCs）虽能抑制HBV释放，但无法靶向HBV持续存在或抗原表达，而正是抗原表达诱导了免疫耐受并具有致癌特性。HBV以共价闭合环状DNA（cccDNA）形式持续存在于感染细胞核中，驱动病毒复制和抗原表达；整合的HBV-DNA也可贡献于抗原表达。此前，研究人员已展示了一种联合策略：先用小干扰RNA（siRNA）抑制免疫抑制性病毒抗原，两个月后以治疗性乙型肝炎疫苗TherVacB进行免疫接种，该疫苗利用异源初免-加强策略以最佳刺激广泛的抗病毒免疫，特别是HBV特异性T细胞应答，此联合方案在HBV携带小鼠中实现了HBV控制。相比之下，单独使用NUCs限制HBV复制或从血液中清除HBeAg或HBsAg均无法使TherVacB克服HBV特异性免疫耐受。

目前已有多种siRNA和反义寡核苷酸（ASOs）在慢性乙型肝炎患者中证明了安全性和抑制HBV抗原的潜力。siRNA与免疫刺激剂（如Fc优化的T细胞刺激性单克隆抗HBs抗体、聚乙二醇化干扰素α-2a、TLR8激动剂、PD-1拮抗剂或治疗性疫苗）的联合方案正在临床评估中。此类联合治疗方案的临床成功可能取决于基线HBsAg水平、最佳siRNA剂量以及免疫刺激前抗原抑制的持续时间。然而，最重要的问题是长期抗原降低是否能够导致HBV免疫控制的自发恢复，从而省略免疫治疗。本研究即在临床前HBV携带小鼠模型中解决这些问题。

## 关键技术方法

本研究主要使用了两种HBV携带小鼠模型：HBV转基因小鼠（HBVxfs品系，C57BL/6J背景，H-2b/b单倍型）和AAV-HBV感染建立的HBV携带小鼠（C57BL/6J雄鼠，8周龄，经静脉注射含1.2倍超长HBV基因组的AAV载体）。HBV特异性RNA干扰治疗采用经化学修饰并偶联N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）的siRNA（siHBV1、siHBV2）或AAV8载体表达的shRNA（AAV-shHBV），靶向所有HBV转录本的共同区域。治疗性疫苗TherVacB采用异源初免-加强方案：第0天和第14天肌肉注射含HBsAg和HBV核心抗原的病毒样颗粒（佐剂为环二腺苷酸单磷酸c-di-AMP），第28天以表达HBV S或核心蛋白的重组修饰痘苗病毒安卡拉株（MVA）加强免疫。研究采用化学发光免疫分析法检测血清HBsAg、HBeAg、抗-HBs和抗-HBe水平，定量实时PCR检测血清HBV DNA，实时RT-PCR检测肝内HBV RNA；通过流式细胞术进行胞内细胞因子染色（ICS）分析HBV特异性T细胞应答；并对肝组织进行HE染色和HBc、HBs免疫组化染色。此外，研究还对肝组织进行了批量RNA测序（Illumina NovaSeq X Plus平台）以分析转录组变化。

## 研究结果

**siRNA剂量对抗原抑制的影响**：研究人员首先考察了增加siRNA剂量是否能增强抗原抑制效果。对高抗原表达HBV转基因小鼠（HBVxfs品系）分别皮下注射3 mg/kg或9 mg/kg的siHBV-1或siHBV-2。结果显示，两种剂量对HBsAg和HBeAg的抑制效果相当；较高剂量对血清HBV DNA和肝内HBV RNA的抑制更强，但此差异临床意义有限，因NUCs已能高效阻断HBV复制。因此后续实验选用3 mg/kg剂量。

**延长RNAi预处理增强治疗性疫苗疗效**：研究人员探究了siRNA抑制HBV抗原的持续时间对后续TherVacB疗效的影响。对HBV转基因小鼠分别进行3周、6周或8周siRNA预处理后再接种疫苗。结果显示，虽然各组在疫苗接种前血清抗原水平均已降至相当低的水平，但siRNA预处理时间更长的小鼠在接种疫苗后HBsAg下降更显著，诱导了更强的肝内CD8 T细胞应答，表现为更低的肝内HBV RNA水平和更少的HBc阳性肝细胞。为排除额外siRNA剂量的影响，研究人员进一步使用shRNA表达AAV载体实现恒定的RNA干扰， confirming将抗原敲低时间从3周延长至6周可增强TherVacB诱导抗病毒T细胞应答的能力。

**肝内抗原水平下降慢于血清水平且与疫苗疗效相关**：为理解为何延长抗原抑制时间有益于抗病毒免疫诱导，研究人员利用AAV-shRNA载体治疗HBV转基因小鼠，并在3周、5.5周和8周时终止实验。免疫组化分析显示，虽然血清HBsAg和HBeAg在2-3周内即达到最大抑制，但肝内HBsAg和HBc的抑制在3周时仍不完全，直至5.5周才达最低水平。流式分析未发现RNAi持续时间对肝内髓系来源抑制细胞（MDSCs）、库普弗细胞、NK细胞、NK T细胞或调节性T细胞（Tregs）比例有显著影响。

**I型IFN反应的恢复与HBV抗原抑制持续时间相关**：通过批量RNA测序分析肝内转录组，研究人员发现与shCtrl相比，shHBV处理8周有610个基因显著调控；而shHBV处理8周与3周相比，有1600个基因调控，表明此时间段内发生了主要转录变化。基因集富集分析（GSEA）鉴定出11条与观察到的免疫表型相关的信号通路，其中主导模式为I型IFN反应的恢复，此外还有双链RNA结合、抗病毒固有免疫应答、病毒防御应答和IFN-γ应答等相关通路。这提示HBV通过抑制包括I型IFN信号在内的固有免疫来建立免疫耐受。

**长期抗病毒siRNA治疗未能实现HBV治愈**：研究人员在AAV-HBV模型中考察了长期siRNA单药治疗的效果。小鼠接受每月一次siRNA注射，持续28周。结果显示，HBV抗原水平在首次siRNA应用后急剧下降，16周左右达平台期；虽有两只小鼠出现HBsAg清除和抗-HBs血清学转换，但HBeAg持续阳性，表明HBV基因组持续存在。长期治疗未引起可检测的副作用。治疗结束时，HBc阳性肝细胞和肝内HBV RNA均显著减少，但未实现HBV消除。

**长期siRNA单药治疗未导致T细胞免疫重建**：经过7个月siRNA治疗后，研究人员从肝和脾分离免疫细胞，通过HBV特异性多聚体染色和胞内细胞因子染色评估抗病毒T细胞应答。即使经过长期抗原抑制，既未检测到HBV特异性CD8 T细胞（使用S190和C93多聚体），也未能在HBV肽库再刺激后检测到CD8或CD4 T细胞应答。即使在出现抗-HBs血清学转换的两只小鼠中亦然，但治疗性179疫苗接种后则可检测到。这表明长期siRNA介导的抗原降低不能使HBV携带小鼠自发恢复T细胞免疫。

**siRNA治疗停止后持久HBV控制需要免疫刺激**：为更系统地探究病毒抗原抑制至检测限以下是否能恢复HBV特异性免疫，研究人员在低滴度HBV携带小鼠（血清HBsAg 50-100 IU/ml）中进行实验，给予四次siRNA注射使血清HBsAg和HBeAg降至检测限以下。12周后，一半小鼠接受TherVacB免疫，另一半不予处理。结果显示，未接种疫苗的小鼠未出现抗-HBs血清学转换，停止siRNA后HBV复制反弹，血清抗原水平恢复至基线；而所有接种疫苗的小鼠均产生抗-HBs抗体，血清抗原维持于检测限以下，且可检测到HBV反应性CD8 T细胞和轻度ALT升高。这表明即使起始抗原水平低且长期抑制至检测限以下，免疫刺激治疗仍是实现持久HBV控制的必要条件。

## 讨论与结论翻译

本研究回答了优化慢性乙型肝炎联合治疗的关键问题。研究巩固了肝内而非循环HBV抗原水平是HBV免疫耐受主要决定因素的观点，并确认T细胞是HBV控制的关键介导者。研究主张在应用刺激抗病毒T细胞的免疫治疗前，先用抗病毒药物长时间抑制肝内病毒抗原表达。作为促成因素，研究鉴定了I型IFN信号恢复的参与。

研究结论如下：数据22表明，除抑制病毒抗原外，免疫刺激对于实现治疗停止后的持久HBV控制也是必要的。这些结果将有助于设计能够最终实现HBV控制的临床试验。此外，研究结果强调，血清病毒参数消失甚至抗-HBe/HBs血清学转换不应作为治愈性治疗的最终目标，而应被视为增强免疫刺激药物诱导治愈性T细胞反应的先决条件。