植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)源抗菌肽YAMP1——抗刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)感染的安全候选分子

《Journal of Agriculture and Food Research》：Antimicrobial peptide YAMP1 derived from Lactiplantibacillus plantarum: A Safe Candidate to Combat Toxoplasma gondii Infection

　　

摘要：刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，T. gondii)是一种食源性人畜共患寄生原虫，可感染包括人类在内的所有温血动物。目前尚无广泛适用的疫苗或特效药物，临床治疗主要依赖抗生素，但疗效有限且具有一定毒副作用。乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)源抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)安全性高，不易诱导耐药性。研究人员基于植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)源抗菌肽Y8-2的鉴定，经合成与筛选获得本研究用抗菌肽YAMP1，其氨基酸序列为QGHLNSPTTVNRSLNALR，对速殖子(tachyzoite)杀灭率为85.74％(P＜0.0001)。YAMP1可特异性靶向并破坏速殖子表面SAG1蛋白，导致胞内内容物渗漏。BALB/c小鼠灌胃给药后发现，YAMP1在感染后第10天(10 dpi)可缓解肠道炎症并降低多组织器官虫负荷；此外减轻脑组织炎症并显著减少脑包囊数目(降低60.7％，P＜0.001)。YAMP1还可显著降低T. gondii感染后大肠杆菌属(Escherichia)丰度，增加阿克曼氏菌属(Akkermansia)和乳酸杆菌属(Lactobacillus)丰度。代谢组学分析显示YAMP1显著影响代谢变化，在原代胆汁酸代谢及色氨酸代谢等通路上显著富集，有助于缓解T. gondii感染。本研究拓展了刚地弓形虫感染潜在替代治疗方案的探索方向，并为LAB源抗菌肽用于弓形虫病治疗提供数据支持，拓宽了LAB源抗菌肽开发利用前景。

植物乳杆菌源抗菌肽YAMP1抗刚地弓形虫感染的作用及机制研究解读

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)为全球流行的人畜共患食源性原虫，约三分之一人群血清阳性，可致孕妇胎儿畸形、免疫低下宿主重症病变，目前无适用于人的疫苗，临床常用磺胺嘧啶联合乙胺嘧啶仅对急性期有效且有骨髓抑制毒性。抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)具广谱抗菌、不易耐药等优势，但多数来源安全性不足；乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)作为公认益生菌，其源抗菌肽安全性高，而关于LAB源抗菌肽抗弓形虫体内外系统研究较少。研究人员前期从马奶酒(koumiss)中分离出产抗弓形虫肽的植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum) Y8菌株，粗肽Y8-2对速殖子有杀灭作用，本研究在此基础上鉴定、合成并筛选获得新型抗菌肽YAMP1，系统探讨其对T. gondii感染体外杀灭及体内干预效果与机制，论文发表于《Journal of Agriculture and Food Research》。

研究人员采用的主要关键技术方法如下：从马奶酒分离的植物乳杆菌Y8发酵液粗肽Y8-2经HPLC/MS鉴定肽段并固相合成，通过流式细胞术PI染色筛选具最高速殖子杀灭率的肽段命名为YAMP1；圆二色光谱(circular dichroism，CD)分析二级结构；扫描电镜(SEM)与透射电镜(TEM)观察速殖子超微形态；分子对接(HDOCK)与100 ns分子动力学(molecular dynamics，MD)模拟分析YAMP1与T. gondii表面抗原1(SAG1，PDB ID: 1ynt)互作；Western blot检测SAG1蛋白水平；建立BALB/c小鼠口服PRU株包囊感染模型(5个包囊)，设正常对照(NC)、感染对照(IC)、YAMP1灌胃(10 mg/kg)组，于10 dpi与30 dpi取材；qRT-PCR以B1基因定量组织虫负荷；H&E染色评估小肠及脑组织病理；镜下计数全脑包囊；ELISA检测血清细胞因子；16S rRNA基因测序分析粪便菌群；非靶向代谢组学及KEGG富集分析粪便代谢物。

3.1. Identification and screening of antimicrobial peptides and its killing effect on tachyzoites

研究人员对植物乳杆菌Y8产粗肽Y8-2经HPLC/MS鉴定得到31条氨基酸序列，预测其中12条具α?螺旋结构并固相合成，流式细胞术PI染色显示第6号肽对T. gondii速殖子杀灭率最高(85.74％，P＜0.0001)，命名为YAMP1(序列QGHLNSPTTVNRSLNALR)；浓度梯度实验显示40 μg/mL与80 μg/mL杀灭率无显著差异，选40 μg/mL用于后续体外实验；该浓度下YAMP1对宿主细胞毒性低且无溶血；CD光谱显示YAMP1在水相(PBS)中为无规卷曲，在疏水环境(50％ TFE)中形成α?螺旋，证实其为两亲性α?螺旋抗菌肽。

3.2. YAMP1 modified the structure of tachyzoites

SEM显示PBS对照组速殖子呈典型新月形、表面光滑，YAMP1(40 μg/mL，30 min)处理后速殖子丧失完整新月形态，表面皱缩变形；TEM显示对照组速殖子内部细胞器排列完整，YAMP1处理后速殖子畸形、细胞膜破裂、胞质空泡化、细胞器结构紊乱，表明YAMP1可物理破坏速殖子膜结构与内部结构致其死亡。

3.3. YAMP1 targets and disrupts the SAG1 protein through stable molecular interactions

分子对接显示YAMP1嵌入SAG1蛋白口袋，SAG1残基LYS₂₂₂₃、Thr₂₂₁₈、Asp₂₂₁₄、Trp₂₀₈₀、Ser₂₀₇₉与YAMP1残基Gln1、Thr8、Asn15、Arg18、Leu17形成氢键，SAG1残基Pro₂₁₆₀、Met₂₁₆₃、Val₂₁₃₉、Ile₂₀₉₉、Pro₂₀₉₈、Val₂₀₉₇、Trp₂₀₈₀与YAMP1残基Leu4、Pro7、Leu14、Leu17形成疏水相互作用；100 ns MD模拟显示RMSD于80～100 ns达平衡，回旋半径(Rg)稳定于~2.21 nm，体系形成最多7个氢键，结合自由能计算表明相互作用强且稳定；Western blot显示YAMP1处理使速殖子SAG1蛋白水平显著降低55.79％，证实YAMP1靶向结合并破坏SAG1。

3.4. Effect of YAMP1 on intestinal inflammation and tissue parasitic load in T. gondii infection

小鼠感染T. gondii PRU株包囊后10 dpi，IC组小肠绒毛缩短、隐窝变浅、炎性浸润明显、杯状细胞受损，YAMP1组小肠绒毛结构较完整、上皮损伤减轻、炎性浸润减少；qRT-PCR显示IC组脑、心、肺虫负荷较高，YAMP1干预显著降低脑、肝、脾、肾虫负荷(肺除外)。

3.5. Effect of YAMP1 on brain inflammation and cyst count

感染30 dpi，IC组脑组织见明显炎症浸润及血管袖套，YAMP1组脑炎症显著减轻；YAMP1组小鼠全脑包囊数较IC组显著减少(降低60.7％，P＜0.001)，组织切片确认包囊数目减少。

3.6. Effect of YAMP1 on serum cytokine level

10 dpi时YAMP1组血清IFN?γ(interferon?γ)、TNF?α(tumor necrosis factor?α)显著升高(P＜0.0001)，IL?12 p70、IL?10(interleukin?10)亦升高(P＜0.05)；30 dpi时IL?6水平升高(P＜0.05)，其余因子仍维持较高水平，整体较10 dpi有所回落，提示YAMP1促进Th1型免疫应答并维持免疫稳态。

3.7. Effect of YAMP1 on the gut microbiota

16S rRNA测序显示10 dpi时YAMP1回调拟杆菌门(Bacteroidota)与变形菌门(Proteobacteria)丰度，属水平显著降低埃希氏菌属(Escherichia)丰度、升高阿克曼氏菌属(Akkermansia)丰度；30 dpi时多个门水平菌群恢复，属水平显著升高乳酸杆菌属(Lactobacillus)丰度；PCoA与LEfSe分析表明YAMP1干预使菌群结构向健康状态恢复，抑制机会致病菌富集。

3.8. Effect of YAMP1 on fecal metabolites

非靶向代谢组学PLS?DA显示各组明显分离；10 dpi差异代谢物显著富集于原代胆汁酸生物合成(primary bile acid biosynthesis)通路，组氨酸代谢下调提示组胺相关炎症减轻；30 dpi显著富集色氨酸(tryptophan)代谢通路，吲哚?3?乙醇升高可能通过芳烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AhR)抑制过度炎症；YAMP1整体调节感染引起的代谢紊乱。

讨论部分总结：YAMP1具两亲性α?螺旋结构，通过靶向T. gondii速殖子表面SAG1蛋白形成稳定氢键与疏水相互作用，插入并破坏膜完整性致胞内物质泄漏、细胞死亡，与SEM/TEM及Western blot结果吻合。口服YAMP1减轻T. gondii引起的小肠炎性损伤，可能通过体内抑制速殖子活性及协同宿主内源性抗菌肽实现；YAMP1降低多器官(尤其脑、肝、脾、肾)虫负荷，与促进IL?12依赖的IFN?γ Th1应答及IL?10免疫调节有关。慢性期YAMP1减少脑包囊及神经炎症，与持续升高的TNF?α、IL?6协同促进IFN?γ控制缓殖子活化相关。YAMP1纠正T. gondii感染致菌群失调——抑制大肠杆菌属、促进阿克曼氏菌属与乳酸杆菌属，利于肠黏膜屏障修复；上调原代胆汁酸合成相关代谢、调节色氨酸?AhR轴，共同缓解系统炎症。研究证实植物乳杆菌源抗菌肽YAMP1具直接杀速殖子及系统免疫、菌群、代谢调节作用，是抗弓形虫感染的潜在安全候选分子，也为LAB源抗菌肽开发应用提供依据。

结论部分翻译：植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)源抗菌肽YAMP1可靶向并结合刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)表面抗原1(SAG1)蛋白，破坏速殖子细胞膜并产生杀速殖子效应。此外，YAMP1可缓解T. gondii感染小鼠的肠道与脑部炎症，降低组织虫负荷及脑组织包囊数量。YAMP1还可调节宿主肠道微生物群组成与代谢谱，并发挥免疫调节作用。综上，YAMP1在体外与体内均表现出抗T. gondii抑制效应，本研究一方面为T. gondii感染治疗提供了新策略，另一方面拓宽了乳酸菌源抗菌肽的开发与利用前景。