综述：同位素编辑电子自旋回波包络调制：一种探测神经退行性疾病蛋白铜结合位点的新方法

《Journal of Biological Chemistry》：Isotope-Edited ESEEM: A New Method for Probing Copper Binding Sites in Neurodegenerative Proteins

　　

神经退行性疾病蛋白中固有无序结构域的相互作用常由铜、锌等生理金属离子稳定，表征此类体系中金属离子的配位环境对评估相关蛋白质相互作用的稳定性与组织形式至关重要，但受限于相关蛋白结构缺乏规则分子有序性，该表征工作存在显著挑战。研究人员近期开发了一种新型脉冲电子顺磁共振(EPR)方法，利用选择性15N同位素标记的电子自旋回波包络调制(ESEEM)技术实现突破。与Cu2+配位的组氨酸侧链，其含14N或15N的残基在ESEEM及其二维联用方法HYSCORE中可产生完全可分辨的特征信号。该方法被应用于细胞型朊病毒蛋白(PrPC)，用于探究其原本具有神经毒性的无序N端结构域如何通过Cu2+连接至其球状C端结构域实现调控。研究人员通过分选酶介导的连接技术构建了仅在N端结构域携带区段15N标记的鼠源朊病毒蛋白表达体系，同位素编辑ESEEM成功鉴定出参与这一关键调控过程的来自两个结构域的特定组氨酸残基。将该方法的适用范围拓展至异源蛋白复合物后，研究聚焦于Cu2+如何促进PrPC与β淀粉样蛋白(Aβ)的相互作用——后者是阿尔茨海默病老年斑的核心组分。将15N标记的PrPC与未标记的Aβ结合的研究显示，两种蛋白可同时配位Cu2+，且Aβ仅贡献单个组氨酸侧链参与配位。综上，本综述证实同位素编辑ESEEM是一种可在有序及无序蛋白复合物中实现金属配位残基特异性解析的有效方法。

引言

阿尔茨海默病(AD)等常见神经退行性疾病的发病机制与特定肽段或蛋白质的异常积累及后续斑块形成密切相关。AD早期以40~43个残基的β淀粉样蛋白(Aβ)肽段积累并形成老年斑为特征，随后伴随胞内tau蛋白包涵体形成，最终引发神经原纤维缠结与神经元死亡。此类疾病的发生会导致脑内生理金属离子分布发生重编程：早期研究发现AD患者中枢神经系统铜水平呈区域依赖性降低，而铁、锌水平升高；后续动物实验与死后人脑组织分析进一步证实，铜会在Aβ富集的老年斑中发生特异性蓄积。类似现象也存在于朊病毒疾病中——正常细胞型朊病毒蛋白(PrP^C)错误折叠并聚集为具有致病性、传染性的瘙痒型朊病毒蛋白(PrP^Sc)的过程中，PrP^Sc聚集位点可观察到铜、锌水平的显著升高。已有大量综述系统讨论了铜在神经退行性疾病中的潜在作用。

Aβ、PrP^C以及帕金森病相关胞内蛋白α-突触核蛋白均为高亲和力铜结合蛋白，且均优先与胞外主导铜物种Cu²⁺发生相互作用。然而，上述蛋白的推定结合位点均位于柔性固有无序区域(IDR)，导致Cu²⁺结合模式的具体表征面临巨大困难，这也解释了为何既往针对Aβ与PrP^C的铜结合亲和力、化学计量比及配位模式的报道结果存在显著差异。例如已发表的Aβ-Cu²⁺复合物解离常数(K_d)测量值跨度达四个数量级，介于10 pM至100 nM之间。若铜（尤其是Cu²⁺）确实通过促进单体肽段向斑块转化，或在斑块内赋予有害氧化还原活性参与神经退行进程，则明确其结合亲和力与配位模式具有重要科学意义。

本研究团队长期关注PrP^C的功能机制——该蛋白是疯牛病、慢性消耗病（在落基山脉鹿科动物中持续传播）、人类库鲁病与克雅氏病的致病蛋白。这一约210个残基的蛋白可高效结合Cu²⁺，该相互作用对调控PrP^C固有的神经毒性至关重要。此外，PrP^C在AD中发挥核心作用：既可作为单体与寡聚体Aβ的受体（后者被命名为Aβ_o）。单体Aβ与PrP^C结合后会通过内吞作用发生转运，可能导致其胞内蓄积；而Aβ_o与PrP^C的结合则与跨膜信号传导相关，最终驱动tau蛋白磷酸化与胞内聚集，这两个过程均在AD早期阶段活跃。同时，AD患者淀粉样斑块中可检测到PrP^C的富集，且该蛋白可促进Aβ聚集体的形成。

本综述聚焦可用于揭示Cu²⁺如何调控PrP^C毒性、并促进其与Aβ相互作用的新型电子顺磁共振(EPR)方法。文中首先简要讨论基于EPR及亲和力研究、光谱学、X射线吸收谱等互补方法建立的PrP^C与Aβ的Cu²⁺结合模型；其次介绍利用均匀¹⁵N标记蛋白表达，结合分选酶介导连接(SML)技术实现区段标记的策略，阐明¹⁴N与¹⁵N在电子自旋回波包络调制(ESEEM)中产生的特征脉冲EPR信号如何用于明确Cu²⁺配位环境中的位点特异性组氨酸残基；最后展示PrP^C如何通过铜中心与Aβ发生协同相互作用。本综述证明，先进的EPR技术——同位素编辑ESEEM可有效解决铜配位研究中长期存在的争议。

朊病毒蛋白与阿尔茨海默病Aβ肽段的Cu²⁺结合相关残基

PrP^C包含两个独立结构域：残基23~125的固有无序区域(IDR)，以及残基126~230（小鼠序列去除N端与C端信号肽后）的以螺旋结构为主的球状结构域。早期EPR实验发现，Cu²⁺与PrP^C的结合模式随Cu²⁺与蛋白的比例变化而改变：在低Cu²⁺:PrP^C比例下，Cu²⁺主要由八重复(OR)结构域的组氨酸咪唑基配位，该结构域包含4个含组氨酸的8残基重复序列PHGGXWGQ（其中第2、3个重复中的X根据物种不同为甘氨酸或丝氨酸）。随着Cu²⁺当量升高，非OR区组氨酸残基His95与His110也会参与结合。近期研究进一步发现，在高Cu²⁺:PrP^C比例且pH>6.5的条件下，OR结构域达到饱和，每个重复序列结合1个Cu²⁺当量，配位原子包括组氨酸与骨架甘氨酸酰胺氮。此外，球状结构域的His139与His176也被核磁共振实验证实参与铜结合。

40~43个残基的Aβ肽段是β-分泌酶与γ-分泌酶切割淀粉样前体蛋白(APP)后释放的胞外区产物，其是否具有生理功能仍是研究领域的热点问题，但目前学界已广泛共识Aβ可高亲和力结合Cu²⁺。多种技术已被用于系统研究该相互作用，包括电化学滴定、紫外-可见吸收光谱、核磁共振、连续波EPR、脉冲EPR、X射线吸收与扩展X射线吸收精细结构(EXAFS)光谱以及密度泛函理论(DFT)计算。现有模型提出其赤道配位环境由2个组氨酸咪唑基、N端氨基与1个氧原子（可能来自Asp1侧链或骨架羰基）组成。值得注意的是，PrP^C与Aβ的铜结合位点均依赖组氨酸残基，这是其形成高亲和力Cu²⁺结合位点的结构基础。

电子自旋回波包络调制(ESEEM)：固有无序区域-Cu²⁺相互作用的独特探针

ESEEM由Mims等在脉冲EPR技术开发初期首次证实，目前在电子材料与生物研究中均有广泛应用。若顺磁中心存在弱核耦合，在两脉冲或三脉冲自旋回波序列中扫描脉冲延迟时间，会产生与耦合核频率相关的回波强度时间依赖振荡。Peisach与Mims发现，在9~10 GHz频率下检测Cu²⁺-咪唑样品时，会产生显著的ESEEM调制，其特征频率ν_-、ν₀与ν₊近似匹配¹⁴N（自旋量子数I=1）的四极跃迁。且¹⁴N耦合来源于咪唑环上未直接参与配位的远端氮原子，这一特性为组氨酸残基配位铜中心的鉴定提供了独特优势，尤其适用于神经退行性疾病相关蛋白的研究。¹⁵N（I=1/2）标记的组氨酸同样可产生显著的ESEEM信号，但其跃迁频率与¹⁴N组氨酸存在明显差异：¹⁵N核处于两种自旋态之一，与¹⁵N超精细耦合混合后会产生两个可观测跃迁，标记为ν_α与ν_β。典型耦合参数下铜与¹⁴N或¹⁵N组氨酸配位的能级图与模拟谱已得到充分表征。

除鉴定与铜中心配位的组氨酸咪唑基外，ESEEM还可提供与耦合氮核数目相关的光谱特征，且该特征对两种氮同位素具有特异性：对于¹⁴N，多个组氨酸配位会导致约4.0 MHz处的“双量子”信号强度显著升高；而对于多个¹⁵N组氨酸配位，则会在2ν_α处产生新的信号，该信号来源于|?, ?>态到|-?, -?>态的跃迁，近期已被Smart等系统表征。ESEEM的二维版本——超精细亚能级相关光谱(HYSCORE)可进一步将2ν_α信号解析为独立峰，且额外的¹⁵N耦合会以基频ν_α的整数倍形式显现。研究人员已对三脉冲实验的时序参数进行优化，可同时获得¹⁴N与¹⁵N的特征跃迁信号，并增强2ν_α信号的灵敏度。

铜对朊病毒蛋白神经毒性的调控

PrP^C的两个结构域具有明确功能划分：C端主要为螺旋结构域，N端为延伸的无序区域，其中OR区的组氨酸残基可结合1当量Cu²⁺。特异性删除OR区与C端结构域之间的多肽片段会引发高度毒性，导致转基因小鼠新生儿死亡，并在培养细胞与原代神经元中诱发自发性跨膜电流。因此学界提出假说：单体PrP^C的毒性来源于其N端，该区域被称为“毒性效应结构域”。靶向C端结构域特定表位的单克隆抗体处理野生型PrP^C也可诱导类似的N端驱动的毒性反应，说明C端结构域是N端毒性效应结构域的调控单元。且Cu²⁺是该调控相互作用的必要条件：向具有毒性的PrP^C缺失突变体中添加五甘氨酸铜可消除其毒性跨膜离子电流。

PrP^C的C端调控结构域包含His139与His176两个组氨酸残基。核磁共振实验提示，结合了Cu²⁺的OR结构域可与包含这两个组氨酸的C端表面结合；同时删除这两个组氨酸残基会增强培养神经母细胞瘤(N2a)细胞的自发性电流，提示该调控相互作用依赖于铜桥接两个PrP^C结构域的组氨酸配位。但此前尚不明确具体参与的C端组氨酸种类，以及两个结构域分别贡献的组氨酸数目。

传统EPR方法中，组氨酸与Cu²⁺中心配位产生的信号差异极小，无法区分不同的¹⁴N组氨酸残基。而¹⁴N与¹⁵N组氨酸的特征ESEEM谱差异提示，在区段标记的PrP^C构建体中特异性引入同位素标记的组氨酸，可验证两个结构域是否通过铜发生协同配位。Pavlovici等利用分选酶介导连接(SML)技术实现了PrP^C的区段标记：表达残基23~117的N端结构域并进行均匀¹⁵N标记，再将其与未标记的C端结构域连接，最终构建体在His139与His176位置保留¹⁴N。

对携带1当量铜的区段同位素标记PrP^C进行ESEEM与HYSCORE检测，可同时观测到¹⁴N与¹⁵N组氨酸的特征信号；且两类谱图中均存在2ν_α信号，表明有多个OR区组氨酸参与配位。而对¹⁴N 4.0 MHz峰的分析提示仅有单个C端组氨酸参与配位。后续诱变研究明确His176是铜配位与调控N端毒性的关键残基。引入单个Cu²⁺离子的AlphaFold 3模拟结构与EPR实验结果完全一致：Cu²⁺同时与球状结构域的His176及N端OR区的三个组氨酸配位。

铜通过协同配位锚定Aβ至PrP^C

胞内Aβ(iAβ)的蓄积正成为AD的独立致病因素，其作用可能与经典的胞外Aβ聚集斑块形成通路平行：iAβ可定位于线粒体等细胞器，最终破坏细胞功能。培养细胞实验显示，PrP^C可通过内吞作用将荧光标记的Aβ跨质膜转运。鉴于PrP^C与Aβ均具有高亲和力铜结合能力，研究人员推测朊病毒蛋白的Cu²⁺中心可能是Aβ的结合锚定位点。

研究人员将均匀¹⁵N标记的PrP^C与未标记的Aβ（非聚集性全长Aβ片段）共同孵育，结合同位素编辑ESEEM技术开展分析。单独的Aβ与1当量铜结合的ESEEM谱中可观察到显著的4.0 MHz信号，表明多个组氨酸参与配位，与Aβ含有多个组氨酸残基的特征一致；¹⁵N-PrP^C的ESEEM谱则显示2ν_α信号，提示多个组氨酸参与配位。而当PrP^C、Aβ与Cu²⁺按1:1:1比例形成三元混合物时，ESEEM与HYSCORE谱中同时出现两种同位素的特征信号；但与单独Aβ-铜复合物相比，三元混合物的¹⁴N 4.0 MHz ESEEM信号显著降低，同时2ν_α跃迁仍然存在。这些结果提示该配位环境由PrP^C的多个组氨酸与Aβ的单个组氨酸共同构成。即使将铜浓度降至低于1当量（其余条件保持PrP^C:Aβ=1:1），ESEEM谱仍与前述三元复合物一致，说明该三元复合物具有热力学稳定性，为PrP^C介导Aβ转运的配位模型提供了有力证据。

上述实验从分子层面提出了PrP^C与Aβ相互作用的可验证假说，解释了PrP^C介导Aβ内吞的机制：PrP^C通过内吞作用转运Aβ可能是正常细胞生理过程的一部分，Aβ最终通过溶酶体降解途径清除；但当胞外Aβ水平过高时，该降解通路可能被过载，最终导致iAβ蓄积。阐明Aβ的相关转运通路，并进一步明确PrP^C:Aβ:Cu²⁺复合物的结构细节，有望为AD治疗靶点的识别与新策略开发提供全新视角。

结论

ESEEM与HYSCORE是解析神经退行性疾病相关蛋白固有无序区域-Cu²⁺复合物结构细节的理想方法。通过同位素编辑脉冲EPR技术，研究团队拓展了这类成熟方法的应用边界，为PrP^C毒性调控与PrP^C介导Aβ转运的机制研究提供了全新见解。期待本文综述的方法能够推动针对老龄化人群神经退行性疾病的新概念与治疗策略的开发。