中性及酸性条件下原料与巴氏杀菌牛乳中的蛋白酶活性及酪蛋白水解

《Journal of Dairy Science》：Protease activities and casein proteolysis in raw and pasteurized bovine milk under neutral and acidic conditions

　　

本研究阐明了特定牛乳蛋白酶在产生牛乳独特水解模式及肽谱中的作用。具体而言，研究人员分析了原料乳与巴氏杀菌乳中纤溶酶（plasmin）及溶酶体蛋白酶——组织蛋白酶D（cathepsin D）和组织蛋白酶B（cathepsin B）的活性。样品在其酶最适pH条件下（纤溶酶为pH 6.7，溶酶体蛋白酶为pH 5.0）于37°C孵育。通过尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳（urea-PAGE）和超高效液相色谱（UPLC）监测3 d内的蛋白酶活性及酪蛋白水解情况，其中urea-PAGE用于评估完整酪蛋白及较大水解片段的降解，UPLC用于检测可溶性低分子量肽的积累。7 d后进一步采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）表征肽谱，以获得更大的肽积累量并提高蛋白酶特异性水解模式的分辨率。总体而言，pH对蛋白水解具有显著影响；UPLC和LC-MS分析均表明，酸性条件下总肽丰度较中性pH显著降低。然而，pH的影响并非仅限于简单降低蛋白水解程度。实际上，酸化诱导了活性蛋白酶之间平衡的改变，这直接转化为底物偏好性和酪蛋白水解模式的变化。在37°C下，中性pH原料乳中纤溶酶活性随时间逐渐下降，而溶酶体蛋白酶活性在24 h后急剧降低。在这些条件下，α_s1-酪蛋白和β-酪蛋白是主要底物。在中性pH下，纤溶酶主要水解β-酪蛋白产生γ-酪蛋白，而组织蛋白酶D可能与α_s1-I-酪蛋白的形成相关。在酸性pH下，尽管总肽产量较低，但蛋白水解模式转向优先水解α_s2-酪蛋白和κ-酪蛋白，这主要由组织蛋白酶D驱动，也可能涉及AprX（一种细菌金属蛋白酶）。相比之下，组织蛋白酶B在两种pH条件下对完整酪蛋白的水解参与甚微，表明其具有更 specialized 的功能性作用。热处理进一步调节了蛋白酶动态。高温短时巴氏杀菌（72°C，15 s）后纤溶酶活性未显著降低，且在孵育期间有所增加；而溶酶体蛋白酶活性则因巴氏杀菌显著降低，并在整个孵育期间进一步下降。综上所述，这些发现表明pH和热处理不仅通过影响总酶活性来调控牛乳蛋白水解，还通过改变蛋白酶平衡来重新定义酪蛋白底物利用和肽生成模式。

本研究旨在探究牛乳中特定内源性蛋白酶在蛋白水解过程中的作用机制，相关成果发表于《Journal of Dairy Science》。牛乳含有复杂的蛋白酶系统，包括活性酶、酶原、抑制剂和激活剂，共同影响蛋白水解及乳制品品质。其中，纤溶酶是牛乳天然pH下的主要蛋白酶，而组织蛋白酶D和B等溶酶体蛋白酶主要来源于体细胞和乳腺细胞。这些蛋白酶因其最适pH和底物特异性的差异，导致不同的酪蛋白水解模式。此外，热处理对乳中蛋白水解系统具有显著影响：高温短时（HTST）巴氏杀菌可提高纤溶酶活性，而超高温（UHT）处理则显著降低其活性。以往研究多聚焦于单一蛋白酶，而本研究创新性地同时监测多种内源性蛋白酶在适宜条件下的动态变化及其对蛋白水解的集体贡献，以填补该领域空白。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：从爱尔兰Askeaton地区某牧场109头奶牛采集原料乳，等量混合后部分经HTST巴氏杀菌（72°C，15 s）处理；通过添加特异性抑制剂（如aprotinin抑制纤溶酶、pepstatin A抑制组织蛋白酶D、CA-074抑制组织蛋白酶B）和pH调节（使用葡萄糖酸-δ-内酯GDL酸化至pH 5.0）建立不同处理组；采用基于荧光底物的微孔板法分别测定纤溶酶、组织蛋白酶D和B的活性；利用urea-PAGE分析酪蛋白整体降解模式；通过RP-UPLC分离肽段；采用Orbitrap Fusion Lumos质谱仪进行LC-MS/MS肽谱分析；使用RStudio进行统计分析与数据处理。

研究结果部分，"不同处理条件下纤溶酶、组织蛋白酶D和组织蛋白酶B活性随时间变化"显示：原料乳纤溶酶活性在72 h孵育期间无显著变化，而巴氏杀菌乳纤溶酶活性随孵育显著升高（D0与D3相比P=0.0075）；组织蛋白酶D和B活性在24 h内显著下降，巴氏杀菌显著降低两者活性；酸化至pH 5.0对组织蛋白酶D活性无显著影响，但使组织蛋白酶B活性显著降低。"urea-PAGE分析酪蛋白水解模式"结果表明：β-酪蛋白在各样品中均发生主要水解，巴氏杀菌乳3 d后β-酪蛋白显著减少，γ₁-和γ₂-酪蛋白条带更明显，并出现γ₃-酪蛋白条带；α_s1-和α_s2-酪蛋白也有减少但程度较轻；aprotinin处理后β-酪蛋白降解减轻；酸化样品γ-酪蛋白水平与原料乳相近，表明纤溶酶在酸性条件下活性有限；酸化样品中观察到与组织蛋白酶D相关的α_s1-酪蛋白下方特征条带（band B）。"UPLC分析蛋白酶特异性肽谱模式"结果显示：肽积累随孵育时间增加amping；3 d后巴氏杀菌乳肽丰度显著高于原料乳，特别是在10-36 min保留时间窗口；aprotinin处理降低肽丰度，pepstatin处理使酸化乳肽丰度大幅减少，而CA-074处理仅引起有限降低。"质谱分析肽谱"结果表明：7 d孵育后原料乳总肽强度较未孵育增加8.97倍；aprotinin处理降低肽丰度但仍高于未孵育；pH 5.0时总肽强度低于中性pH，pepstatin进一步降低；α_s1-和β-酪蛋白水解趋势与总肽丰度一致，而α_s2-和κ-酪蛋白肽谱显示不同模式——α_s2-酪蛋白肽在pH 5.0时最丰富，κ-酪蛋白肽在酸化乳中更明显。"纤溶酶和组织蛋白酶D对个别酪蛋白水解的贡献"部分显示：纤溶酶活性相关肽在β-酪蛋白中最多，其次为α_s1-和α_s2-酪蛋白；aprotinin抑制所有酪蛋白的纤溶酶切割位点，特别是对β-酪蛋白；酸性条件下纤溶酶对β-和α_s1-酪蛋白活性大减，但α_s2-酪蛋白的纤溶酶特异性切割位点附近肽丰度基本不变。组织蛋白酶D的β-和α_s1-酪蛋白水解在酸性pH低于中性pH，而α_s2-和κ-酪蛋白水解在酸性条件下更显著；pepstatin显著减少β-、α_s1-和α_s2-酪蛋白水解产物，但增强κ-酪蛋白水解。"纤溶酶和组织蛋白酶D切割位点分布"结果表明：两种蛋白酶在β-酪蛋白水解中作用有限，分别仅占所有肽的12.0%和13.6%；纤溶酶主要在Lys28-Lys29、Lys105-His106和Lys107-Glu108位点切割β-酪蛋白产生γ-酪蛋白片段；组织蛋白酶D切割集中于Trp143-Met144和Ser161-Val162位点。在α_s1-酪蛋白中，仅13.9%和9.6%的肽可分别归因于纤溶酶和组织蛋白酶D，且大量肽无法明确归属。α_s2-酪蛋白水解显示两种蛋白酶的更清晰贡献，其中组织蛋白酶D相关肽主要产生于Leu99-Tyr100切割，且pepstatin处理后该位点肽消失。pH 5.0时α_s2-酪蛋白的所有独特肽均源于此位点的组织蛋白酶D切割。κ-酪蛋白的组织蛋白酶D活性在酸性条件下增强，Leu32-Ser33切割受pepstatin抑制，而Phe105-Met106切割在pepstatin存在时持续。

讨论部分，研究人员首先阐述了荧光测定法的验证与局限性：基于384孔板格式的纤溶酶活性测定、 racca等人建立的组织蛋白酶D测定法，以及新开发的组织蛋白酶B特异性荧光测定法均经特异性抑制剂验证有效；但需强调测得活性为"潜在活性"而非实际蛋白水解活性，因其在最适pH而非孵育pH下测定，且组织蛋白酶B测定含还原剂而孵育过程不含。关于纤溶酶，酸性条件下蛋白水解降低主要源于其碱性最适pH下的亚 optimal 催化活性；巴氏杀菌增强纤溶酶介导的蛋白水解，归因于内源性抑制剂的热灭活；aprotinin验证实验证实纤溶酶在中性pH蛋白水解中的核心作用；urea-PAGE与UPLC/LC-MS的方法学差异解释了为何酸性条件下肽释放减少在色谱法中显著而凝胶电泳中不明显。关于组织蛋白酶D，其在酸性条件下蛋白水解影响最显著；pepstatin处理显著降低pH 5.0时总蛋白水解，证实cathepsin D的重要贡献；urea-PAGE中发现band B（可能为α_s1-I-酪蛋白）在pepstatin存在时消失，表明组织蛋白酶D可产生该 traditionally 视为凝乳酶产物的片段，这对奶酪制造具有重要意义；质谱证实组织蛋白酶D偏好α_s1-和β-酪蛋白，但有趣的是这些酪蛋白的水解在中性pH反而更高，提示pH驱动的是整体蛋白酶平衡而非单一酶催化行为的改变；酸化可能通过胶束结构重组影响底物可及性。特别值得注意的是κ-酪蛋白在酸性条件下的水解：pepstatin处理的酸化乳中κ-酪蛋白水解最高，Leu32-Ser33切割被抑制而Phe105-Met106切割持续，提示pepstatin敏感的cathepsin D抑制后，pepstatin不敏感的蛋白酶（很可能是AprX，一种假单胞菌来源的热稳定锌金属蛋白酶）接管了κ-酪蛋白水解，但这需进一步研究确认。关于组织蛋白酶B，尽管检测到活性但CA-074处理对urea-PAGE和UPLC影响甚微，可能因其主要为二肽基羧肽酶活性而非内肽酶，且实验条件缺乏还原剂导致其实际活性受限；其在乳中的生理作用仍不清楚，可能与乳腺组织稳态相关。

研究结论部分翻译如下：本研究建立了特定蛋白酶活性、 resulting 酪蛋白水解模式与最终肽积累谱之间的直接关键联系。重要的是，研究引入了高灵敏度和特异性的荧光测定法，可实现对目标酶活性的精确定量。然而最关键的结论是，仅孤立地考察单一酶无法全面理解牛乳中的蛋白水解过程。研究结果强调，纤溶酶作用于一个更广泛、复杂的蛋白水解网络，其中多种蛋白酶动态相互作用，其活性受pH和热处理等因素的强烈调控。因此，推进对牛乳蛋白水解的理解需要超越仅关注纤溶酶的局限。未来研究应采用综合方法，将灵敏的、蛋白酶特异性的活性测定与全面的肽组学分析相结合。这种联合策略对于充分阐明乳蛋白酶的相互作用以及准确预测 resulting 肽谱及其对乳品质和加工性能的潜在影响至关重要。