D-阿洛酮糖（D-allulose）对鼠李糖乳酪杆菌GG（Lacticaseibacillus rhamnosus GG）发酵乳品质、风味轮廓及益生菌活性的综合影响评价

《Journal of Dairy Science》：Comprehensive evaluation of D-allulose on the quality, flavor profile, and probiotic viability in Lacticaseibacillus rhamnosus GG fermented milk

　　

D-阿洛酮糖作为一种具有前景的蔗糖替代品，其对益生菌发酵乳品质的影响尚不明确。研究人员评价了D-阿洛酮 substitute 对鼠李糖乳酪杆菌GG（Lacticaseibacillus rhamnosus GG）与嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）发酵乳中菌株存活率、理化性质、质地、稳定性、感官品质及挥发性风味轮廓的影响。D-阿洛酮糖添加量为0–10%。在此范围内，D-阿洛酮糖维持了两种菌株在发酵乳中的存活率。在测试处理中，中等添加量（特别是3%）与最强的酸化作用、良好的质地特性及最高的整体感官接受度相关。挥发性分析进一步表明，以D-阿洛酮糖替代蔗糖重塑了香气轮廓，减少了部分果香和青香相关气味物质的贡献，同时在中等添加量样品中增强了与黄油香和奶油香相关的酮类物质。总体而言，这些结果表明，中等D-阿洛酮糖添加量（尤其是3%）可改善益生菌发酵乳的整体品质，并支持其作为低热量发酵乳产品中蔗糖替代品的潜在应用。

## 研究背景与问题提出

发酵乳（fermented milk）作为一种营养丰富的乳制品，因其独特的风味和潜在健康益处而具有广泛的市场接受度。在工业生产中，发酵通常以嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）作为发酵剂进行。为改善感官特性，蔗糖常被添加作为甜味剂，但残留的蔗糖会显著增加发酵乳产品的总糖含量，这对需要限制糖摄入的消费者而言并非理想选择。随着消费者对饮食相关健康问题的关注度日益提高，开发兼具良好理化和感官特性的低糖发酵乳产品已成为乳品科学领域的重要研究方向。在此背景下，D-阿洛酮糖（D-allulose，果糖C-3位差向异构体）作为一种重要稀有糖，因其具有蔗糖70%的相对甜度而仅贡献0.3%的热量，被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）认定为"一般认为安全"（Generally Recognized As Safe, GRAS），并于近期在中国获批作为新食品原料，显示出作为传统甜味剂替代品的巨大潜力。

尽管D-阿洛酮糖在烘焙食品和植物基替代品中的应用已有研究，但其在含有鼠李糖乳酪杆菌GG的益生菌发酵乳中的系统研究尚未见报道。鼠李糖乳酪杆菌GG是研究最为广泛的益生菌株之一，具有调节免疫系统、缓解肠道炎症、改善乳糖不耐受等多种益生功能。虽然已有研究将其与传统发酵剂联合用于山羊乳、水牛乳等发酵，但关于非蔗糖甜味剂对其发酵乳品质影响的深入研究仍显不足。因此，研究人员开展了这项研究，旨在探究D-阿洛酮糖替代蔗糖后对发酵效率、产品结构及风味发育的影响机制，为开发高品质低热量益生菌发酵乳提供实践依据。该论文发表于《Journal of Dairy Science》。

## 关键技术方法概述

研究人员采用的主要技术方法包括：以蒙牛乳业提供的全脂生乳为原料，通过甜味等效替代原则设置0%、2%、3%、4%、6%和10%的D-阿洛酮糖添加梯度（对应0%、20%、30%、40%、60%和100%的蔗糖替代率），以丹麦科汉森公司提供的鼠李糖乳酪杆菌GG冻干直投式菌种（Direct Vat Set, DVS）和嗜热链球菌进行37°C发酵至pH约4.6；采用光密度法（OD₆₀₀）和pH监测评价菌株对D-阿洛酮糖的利用特性；依据GB 4789.35–2023标准进行平板计数法活菌计数；利用LUMiSizer^? 611稳定性分析仪进行加速离心稳定性评价；采用TMS-PRO质构仪进行硬度、内聚性、弹性和胶着性等质地参数测定；组织10名经培训的感官评价员进行5分制喜好度感官评价；使用SYKAM S433D氨基酸分析仪进行游离氨基酸（Free Amino Acid, FAA）含量测定；运用FOX 4000电子鼻（E-nose）和α-ASTREE电子舌（E-tongue）进行风味轮廓快速判别；采用气相色谱-质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS）和顶空气相色谱-离子迁移谱（Headspace Gas Chromatography-Ion Mobility Spectrometry, HS-GC-IMS）进行挥发性有机化合物（Volatile Organic Compounds, VOCs）分析，结合相对气味活度值（Relative Odor Activity Value, ROAV）筛选关键香气贡献物质，并通过主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）、层次聚类分析（Hierarchical Cluster Analysis, HCA）和偏最小二乘判别分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis, PLS-DA）等多元统计方法解析数据。

## 研究结果

### D-阿洛酮糖的不可代谢性验证

通过单碳源生长实验，研究人员发现鼠李糖乳酪杆菌GG和嗜热链球菌在仅以D-阿洛酮糖为唯一碳源的培养基中生长严重受限，其生长动力学与无碳源培养基几乎一致，10小时后的光密度增加值分别仅为0.145和0.234，显著低于葡萄糖组的1.084和0.502；相应培养基的pH值也维持在5.5–6.0的较高水平，与无碳源组相近，表明两种菌株均不能有效代谢D-阿洛酮糖作为能量来源。

### D-阿洛酮糖对发酵乳中益生菌存活率的影响

活菌计数结果显示，嗜热链球菌的存活范围为8.89–9.76 log cfu/g，鼠李糖乳酪杆菌GG为8.71–9.17 log cfu/g。6% D-阿洛酮糖组的嗜热链球菌存活率最高（9.76 log cfu/g），而10%组最低（8.89 log cfu/g）；10%组的鼠李糖乳酪杆菌GG存活率最高（9.17 log cfu/g），6%组最低（8.71 log cfu/g）。尽管部分浓度显著降低了特定菌株的存活率（P < 0.05），但所有处理组的活菌数均超过益生菌发酵乳制品推荐的最低水平10⁸ cfu/g（高于FAO/WHO建议的10⁶ cfu/g）。

### D-阿洛酮糖对发酵乳理化性质及质地稳定性的影响

pH和可滴定酸度呈现明显的反向关系。随着D-阿洛酮糖浓度增加，pH值先降后升，在3%添加量时达到最低值（pH = 4.142），可滴定酸度则相应最高，表明该浓度下酸化程度最大。稳定性分析显示，对照样品的稳定性指数最高（物理稳定性最差），所有D-阿洛酮糖添加组的稳定性指数均低于对照组，10%组的稳定性指数最低。质地分析表明，D-阿洛酮糖添加显著提高了发酵乳的硬度、内聚性和胶着性（P < 0.05），其中2%组硬度最高（0.630 N），3%组也明显高于对照；内聚性随浓度增加呈剂量依赖性上升；而弹性则随D-阿洛酮糖浓度增加显著降低。

### D-阿洛酮糖对发酵乳感官特性的影响

感官评价结果显示，外观和颜色各组间无显著差异。3% D-阿洛酮糖组在香气、口感、均匀度及总体感官评分上均表现最优，获得最高的消费者偏好度，表明该浓度下的发酵乳具有最均衡的感官品质。

### D-阿洛酮糖对游离氨基酸组成的影响

游离氨基酸分析显示，总游离氨基酸含量受D-阿洛酮糖添加的显著影响（P < 0.05）。对照组总含量最高（13.114 g/100g），所有D-阿洛酮糖添加组均低于对照。其中3%组为10.670 g/100g，而4%和10%组最低（分别为7.976 g/100g和6.911 g/100g）。与风味前体形成相关的支链氨基酸（缬氨酸Val、亮氨酸Leu、异亮氨酸Ile）和芳香族氨基酸（苯丙氨酸Phe、酪氨酸Tyr）在3%和6%组中相对含量较高。精氨酸为所有样品中第二丰富的游离氨基酸，对照组（2.11 g/100g）和6%组（2.12 g/100g）含量较高。鲜味氨基酸谷氨酸和甜味氨基酸脯氨酸在中等D-阿洛酮糖水平下的共存可能有助于整体风味的复杂性。

### 电子鼻与电子舌响应分析

电子鼻主成分分析表明，第一主成分解释了89.24%的总方差，样品按D-阿洛酮糖浓度呈现清晰分离，6%和10%组聚类在一起，而0%、2%、3%和4%组部分重叠。雷达图显示6%组传感器响应最强，3%组相对较弱。电子舌分析中，前两个主成分解释了97.55%的总方差，对照组与所有D-阿洛酮糖组明显分离，3%、4%和6%组聚类接近，10%组显著分离。10%组的酸味响应最高。

### D-阿洛酮糖对挥发性化合物的影响

GC-MS共鉴定出104种挥发性化合物，包括40种酮类、16种烃类、22种酯类、10种醇类、9种醛类及其他7种。D-阿洛酮糖添加降低了挥发性化合物的总体丰度和多样性。与对照相比，D-阿洛酮糖样品中酮类和醇类的相对丰度降低，而酯类在部分处理中更为突出。基于ROAV > 1的关键香气物质分析显示，香气主导类型发生转变：对照组由2-甲基-3-庚酮主导（果香、青叶香），2%组由5-甲基-(E)-2-庚烯-4-酮主导，3–4%和10%组由2,3-丁二酮主导（黄油香），6%组由丙酸乙烯酯主导。果香酯类2-甲基丁基丙酸酯和醇类1-戊醇在D-阿洛酮糖添加后明显减弱。

HS-GC-IMS进一步鉴定出22种特征挥发性化合物，其中1-丙醇和乙醇与GC-MS结果一致。层次聚类分析显示0%、3%和4%组基于整体挥发性轮廓聚类在一起。偏最小二乘判别分析鉴定出8种关键挥发性标志物（VIP > 1），包括3-甲基-3-丁烯-1-醇、2-壬酮、1-丁醇、乙酸（单体和二聚体）、2-丁酮、3-羟基-2-丁酮和2-庚酮。甲基酮类2-壬酮随D-阿洛酮糖添加量增加而增加，指示向黄油香和奶油香特征的转变。

## 讨论总结

研究人员在讨论中指出，尽管鼠李糖乳酪杆菌GG不能直接代谢D-阿洛酮糖作为主要碳源，但D-阿洛酮糖通过间接生理和基质介导机制影响产品品质，这体现在不同处理间质地、风味及相关理化性质的差异。中等浓度（3–4%）虽未产生最高的益生菌存活率，但导致了更高的酸度，表明中等D-阿洛酮糖可能增强细胞特异性酸化活性从而促进整体发酵代谢，这与先前报道中D-阿洛酮糖促进乳制品乳酸菌产酸和益生菌性能的结果一致。D-阿洛酮糖可能通过调节渗透压平衡和激活保护性应激反应来支持细胞膜完整性、乳糖利用和细胞存活，而非作为可发酵底物；高浓度时过度的渗透压应激可能超出适应能力，导致代谢活性和存活率降低。

硬度、内聚性和胶着性的增强表明形成了更具整体性和抗性的凝胶网络，这与降低的稳定性指数所反映的改善物理稳定性一致。剂效依赖性的内聚性增加提示蛋白质基质内部结合力增强，而弹性的降低反映了更坚实但弹性较差的凝胶特征，通常与结构致密性增加相关。在游离氨基酸、电子舌响应和感官评价的综合分析方面，D-阿洛酮糖主要通过重塑蛋白水解模式和微生物代谢平衡来调节味觉感知，而非均匀增强蛋白质水解。中等D-阿洛酮糖浓度（3–6%）与较高水平的多种味觉活性氨基酸相关，电子舌分析显示中等添加量样品具有相似且平衡的口感轮廓，与3%补充量下观察到的感官偏好一致。高D-阿洛酮糖水平导致酸味相关电子舌响应的显著增加，尽管pH变化不明显，表明有机酸组成和碳通量分布的改变而非总酸度本身贡献了味觉感知。

GC-MS和HS-GC-IMS的联合分析表明，以D-阿洛酮糖替代蔗糖显著重塑了益生菌发酵乳的挥发性轮廓，导致整体挥发性丰度降低和香气组成简化。ROAV评价确认了香气主导从蔗糖对照中的果香和青香相关化合物向中等D-阿洛酮糖水平下由甲基酮类（如2,3-丁二酮和2-庚酮）驱动的黄油香和奶油香的转变。HS-GC-IMS对醛类、短链酸和二聚酮类具有更高灵敏度，揭示了乙酸和甲基酮类随D-阿洛酮糖浓度增加的剂量依赖性变化。多变量分析普遍将酮类和有机酸鉴定为各配方间的重要区分标志物，表明D-阿洛酮糖主要通过改变微生物碳代谢和下游挥发性合成来调节香气形成，而非均匀增强挥发性生成。仪器香气结果与电子鼻、电子舌响应及感官评价结果的一致性，支持了风味感知的整合性解释。氧化和Strecker衍生醛类的减弱对应于电子鼻检测到的青香和尖锐气息的减少，而黄油香酮类和有机酸的主导与中等D-阿洛酮糖水平下平衡的酸味和改善的总体接受度相关。

## 研究结论翻译

D-阿洛酮糖在与鼠李糖乳酪杆菌GG和嗜热链球菌共同制备的发酵乳中显示出作为蔗糖替代品的良好潜力。在测试范围内（<10%），D-阿洛酮糖并未普遍抑制两种菌株的存活率；抑制作用仅在特定浓度下观察到（例如，3–4%对两种菌株，10%对嗜热链球菌）。菌株和浓度依赖性响应表明，D-阿洛酮糖浓度可以调整以调节嗜热链球菌与鼠李糖乳酪杆菌GG的比例，从而提供增强益生菌存活率、改善产酸或调节发酵产品风味的潜力。通过整合微生物计数、酸化行为、质地分析、挥发性轮廓和感官评价，研究表明中等补充量（特别是3%）提供了最为均衡的整体产品品质，包括改善的酸化作用、良好的质地特性、增强的感官接受度，以及以黄油香和奶油香相关化合物贡献更大为特征的改变后的挥发性轮廓。综上所述，这些结果表明D-阿洛酮糖在该发酵乳体系中的作用可能与其作为鼠李糖乳酪杆菌GG主要碳源的直接利用关系较小，而更多地与基质介导和间接生理影响相关。这些发现为D-阿洛酮糖如何用于优化发酵乳制品的结构和风味特性提供了有益见解，从而支持改进型低热量配方的开发。