《Journal of Molecular Recognition》：3D-Printed Structures Versus Drilled Cavities: A Comparison of Microconfinement Methods for Rheological Characterisation of Multicellular Aggregates
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三维（3D）细胞培养系统较传统二维培养具有更高的生理学相关性，因其能更好地模拟天然肿瘤微环境并支持复杂细胞行为的研究。然而，将原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）应用于这些模型面临挑战，原因在于多细胞聚集体固有的不稳定性给可
三维（3D）细胞培养系统较传统二维培养具有更高的生理学相关性，因其能更好地模拟天然肿瘤微环境并支持复杂细胞行为的研究。然而，将原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）应用于这些模型面临挑战，原因在于多细胞聚集体固有的不稳定性给可重复的力学特性测量带来了困难。为此，研究人员开发并评估了两种不同的多细胞聚集体约束策略以用于AFM分析。第一种方法中，聚集体被包封于多孔三维打印截头圆锥微结构中，该结构通过双光子聚合（two-photon polymerisation, 2PP）技术制备，设计初衷是允许培养基灌注，假设其可通过增强受限环境中的流体可及性来改善营养与代谢物交换。第二种方法则是在聚甲基丙烯酸羟乙酯（poly(2-hydroxyethyl methacrylate), PolyHEMA）包被的培养皿底部微加工圆柱形腔体，为聚集体滞留提供简便而稳健的平台。两种方法均能在不损害细胞完整性的前提下有效约束聚集体，实现了刚度和粘弹性的可重复、可靠测量。研究人员采用人胰腺癌细胞系PANC-1，分别以单细胞及单一种类聚集体形式进行研究。与贴壁单细胞相比，两种约束系统中的聚集体均表现出更低的刚度，提示三维环境中细胞骨架张力降低且重塑过程发生改变。在两种方法中，圆柱形腔体提供了更可靠的聚集体滞留效果，而三维打印截头圆锥结构则可能通过其多孔结构促进培养基的可及性。综上，这些微约束策略实现了多细胞聚集体的可重复力学表征，并将AFM的应用拓展至肿瘤力生物学及抗癌疗法评估领域。
肿瘤微环境的研究对于理解肿瘤生长、进展及治疗反应具有关键意义。传统二维细胞培养虽被广泛使用，但无法再现体内结构性和物理性线索；三维培养系统则能更准确地模拟细胞-细胞及细胞-基质相互作用，从而克服这一局限。然而，将原子力显微镜应用于三维多细胞聚集体时，聚集体固有的机械不稳定性导致测量难以重复，且常规操作中聚集体从多孔板转移至培养皿的过程易引入变性和机械损伤。为应对这些挑战，研究人员开发了两种互补的聚集体稳定化策略，旨在同一培养皿内完成培养与测量，以实现对胰腺癌细胞聚集体力学特性的精准表征。
第一种策略采用双光子聚合技术制备三维打印截头圆锥微结构，提供精确的空间约束并设计有孔隙以促进培养基可及；第二种策略则在PolyHEMA包被的培养皿底部通过机械钻孔形成圆柱形腔体，利用PolyHEMA抑制细胞粘附的特性使细胞在腔体内以三维构象聚集。两种方法均有效解决了传统游离聚集体在AFM测量中的机械不稳定性和部分解离问题，支持长达数天至数周的连续或重复测量。
研究以人胰腺癌细胞系PANC-1为模型，对比分析了贴壁单细胞、截头圆锥约束聚集体及圆柱形腔体约束聚集体的弹性及粘弹性特性。主要技术方法包括：基于双光子聚合的激光直写微纳加工技术制备多孔截头圆锥结构（孔径20 μm、间距11 μm、高度300 μm、顶部直径500 μm、底部直径800 μm）；数控铣削技术在PolyHEMA包被培养皿底部钻孔（直径500或800 μm、深度300或600 μm）；原子力显微镜力曲线测量结合Hertz模型计算表观杨氏模量；扫频法（1–100 Hz正弦振荡）评估粘弹性，采用幂律结构阻尼模型分解储能模量（storage modulus, E'）与损耗模量（loss modulus, E"），并计算损耗角正切（loss tangent, tan δ = E"/E'）；Wilcoxon秩和检验进行组间差异显著性分析；主成分分析（principal component analysis, PCA）可视化多维粘弹性数据。
研究结果发现：机械特性方面，两种约束几何中的聚集体均表现出较贴壁单细胞更低的储能模量、损耗模量及略高的幂律指数，提示三维环境下细胞骨架张力降低、重塑过程改变。统计分析显示单细胞与两种约束聚集体间弹性模量差异显著（p < 0.01），而两种约束聚集体间差异未达统计学显著性（p > 0.01）。PCA可视化表明单细胞与聚集体在粘弹性空间上分离良好，但两种约束聚集体的力学特性高度重叠，暗示约束几何对稳态力学行为影响有限。长期稳定性与滞留方面，两种约束几何均支持聚集体培养长达37天。圆柱形腔体在接种时具有自然沉降和可重复定位的优势；截头圆锥结构虽偶有PolyHEMA涂层从氧化铟锡（indium tin oxide, ITO）基底局部剥离现象，但不影响稳定后AFM测量的可行性。值得注意的是，圆柱形腔体中的聚集体表现出显著的时间依赖性力学变化（p < 10
-5），而截头圆锥中无显著时间差异，提示几何结构可能通过影响局部物质传输和应力积累进而调控力学适应动力学。
综合以上研究结果，研究人员讨论认为：多细胞聚集体的力学行为主要由单细胞向多细胞组织转变决定，而非约束几何形状。这种转变标志着力学机制从个体皮质张力和局部粘附主导转向由细胞间连接构成的渗透网络所定义的集体力学。聚集体内部应力通过细胞间重排、异质性细胞骨架组织和连接变形得以耗散，表现出增强的粘弹性行为。截头圆锥的多孔结构虽设计用于改善物质传输，但其实验通量受限、操作复杂且手动转移易扰动涂层；圆柱形腔体则提供高通量、稳健且可扩展的平台，更适合长期纵向研究。两种约束策略的核心价值在于为肿瘤力生物学、多细胞重塑及治疗反应研究提供了可靠的AFM应用框架，支持在生理相关条件下对复杂三维细胞系统进行定量力学分析。
研究结论指出：两种微约束策略——三维打印截头圆锥微结构与PolyHEMA包被培养皿中的圆柱形腔体——均能维持多细胞聚集体在标准培养条件下的完整性，并实现粘弹性特性的可靠时序评估。与贴壁单细胞相比，聚集体刚度持续降低，反映了从单细胞力学行为向集体多细胞组织的转变。这些工程化约束平台为探测多细胞聚集体力学提供了可靠手段，拓展了原子力显微镜在复杂三维细胞系统中的应用，并为肿瘤力生物学及其他细胞-细胞组织主导力学行为的3D体外模型研究提供了方法论框架。
