乳脂肪球膜（milk fat globule membrane, MFGM）促进乳酸菌产细菌血清素（serotonin/5-HT）及胞外多糖（exopolysaccharide, EPS）以维持肠上皮细胞分化

《Journal of Dairy Science》：The milk fat globule membrane increases bacterial serotonin and exopolysaccharide production for maintenance of intestinal cell differentiation

　　

摘要：血清素（serotonin/5-hydroxytryptamine, 5-HT）是一种主要在肠道合成、由乳酸细菌（lactic acid bacteria, LAB）产生的神经递质，可通过肠-脑轴（gut-brain axis）经由肠神经系统（enteric nervous system, ENS）调节情绪与精神健康。胞外多糖（exopolysaccharide, EPS）是益生菌LAB产生的复杂代谢终产物，可在肠道中发挥促健康作用。LAB与食物基质成分如乳脂肪球膜（milk fat globule membrane, MFGM）的相互作用可能改变胃肠道内血清素和EPS的产生。本研究旨在明确MFGM补充至LAB培养基能否提高血清素与EPS产量，并探究细菌分泌组（secretome）对肠细胞分化的影响。研究人员从137株LAB中筛选血清素高产菌株，取前10株进行MFGM补充并测定生长曲线，分别于生长期、早稳定期和晚稳定期取样，检测无细胞上清液（cell-free supernatant, CFS）中血清素及EPS含量，并用CFS处理融合后第0天和第7天的Caco-2肠上皮细胞系6 h。提取Caco-2细胞RNA行RT-qPCR分析闭合蛋白（occludin）紧密连接蛋白表达；用RIPA裂解液提取蛋白，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）分析试剂盒检测ALP活性，slot blot检测蔗糖酶-异麦芽糖酶（sucrase-isomaltase, SI）和二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4, DPPIV）。结果表明MFGM有提高部分LAB血清素产量的趋势，并在生长后期显著（p < 0.05）提高选定LAB菌株EPS产量；低浓度某些菌株分泌组代谢产物可显著上调Caco-2细胞occludin表达。结果提示MFGM在维护肠道健康（如预防"肠漏综合征" leaky gut syndrome）方面具较高应用潜力，值得进一步研究。

论文解读：《The milk fat globule membrane increases bacterial serotonin and exopolysaccharide production for maintenance of intestinal cell differentiation》发表于《Journal of Dairy Science》

一、研究背景与立项依据

肠道是体内血清素（serotonin/5-hydroxytryptamine, 5-HT）的主要合成部位，近年发现部分乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）亦可利用色氨酸（L-tryptophan）合成5-HT，菌群代谢产物经肠-脑轴（gut-brain axis）影响宿主生理。胞外多糖（exopolysaccharide, EPS）是LAB分泌的高分子糖类，具保护菌体通过胃肠道、竞争性排斥病原菌黏附、免疫调节及作为益生元被共生菌利用等功能。乳脂肪球膜（milk fat globule membrane, MFGM）是母乳及牛乳中富含磷脂、鞘脂和膜蛋白的生物活性成分，已有研究表明其可促进婴儿神经与肠道发育，并能诱导双歧杆菌EPS合成，但MFGM对LAB产5-HT及EPS的影响及其后续对肠上皮细胞分化的作用尚不清楚。口服外源性5-HT无法穿越血脑屏障且易被消化，而MFGM与LAB联用有望通过增强益生菌存活及有益代谢物（5-HT、EPS）原位产生来维护肠道稳态。因此研究人员假设MFGM补充可提高LAB的5-HT与EPS产量，且其分泌组（secretome）能影响Caco-2肠上皮细胞分化与紧密连接（tight junction）表达，并对此进行验证。

二、主要关键技术方法（简述）

研究人员从俄亥俄州立大学Parker保藏中心137株乳制品来源LAB中筛选5-HT高产株（前10株），以含26.4 mM L-tryptophan的酪蛋白葡萄糖肉汤（casein glucose broth, CGB）及补充0.5% MFGM之CGB培养；用Ehrlich试剂比色法测CFS中5-HT，用苯酚-硫酸法测总糖、DNSA法测还原糖，二者差值计算EPS；测生长曲线取生长期（growth phase）、早稳定期（early stationary phase）、晚稳定期（late stationary phase）CFS。选用Caco-2人结肠腺癌细胞系，融合后第0天（d 0）及融合后第7天（d 7）用稀释CFS处理6 h，提取RNA行RT-qPCR检测闭合蛋白（occludin/OCLN）mRNA相对表达（以ACTB为内参），提取总蛋白行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）比色活性检测及slot blot检测刷状缘酶蔗糖酶-异麦芽糖酶（sucrose-isomaltase, SI）和二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase-4, DPPIV）；数据以Student's t检验及双因素ANOVA（Tukey-Kramer事后检验）分析（p < 0.05为显著）。

三、研究结果

Serotonin and Exopolysaccharide Production（血清素与胞外多糖产量）

MFGM补充使Lactobacillus helveticus 15B、Lacticaseibacillus rhamnosus 24、Lactobacillus amylovorus 32及Lacticaseibacillus paracasei 72A在早/晚稳定期5-HT产量呈升高趋势但未达统计学显著；5-HT多在稳定期高于生长期，提示其为次级代谢产物。Lactobacillus helveticus 4A与Lactobacillus amylolyticus 4B在含MFGM培养基中生长受抑（可能为抑菌或MFGM-菌毛复合物致团聚影响OD读数），仅取生长期样品。EPS方面，MFGM使L. delbrueckii subsp. bulgaricus（3）、L. helveticus（7、15B、25）、L. rhamnosus（24、31B）、L. amylovorus（32）在早和/或晚稳定期EPS显著升高（p值分别为0.0203、0.0084、0.0004、0.0051、0.0409、0.0089、0.0028），其中部分菌株生长期EPS略降提示需适应期。结论：MFGM倾向提升特定LAB稳定期5-HT产量，并显著促进多株LAB EPS合成，尤以晚稳定期为著。

Membrane Enzyme Detection in Caco-2 Cells as Index of Differentiation（以Caco-2细胞膜酶为分化指标）

Caco-2细胞d 7总蛋白约为d 0三倍，符合分化进程。ALP活性d 7较d 0显著升高，中浓度CFS组（Medium）ALP活性升高达12.2倍，低+MFGM与高浓度组亦有升高趋势，各处理组与阴性对照无统计学差异，表明LAB CFS不影响正常分化。SI与DPPIV蛋白表达各处理组与阴性对照相比无显著差异，d 7组内偏差减小提示细胞成熟后刷状缘酶表达趋于稳定。结论：所选LAB CFS（含/不含MFGM诱导）对Caco-2细胞刷状缘分化标志酶无不良影响，维持正常肠上皮分化表型。

Expression of Tight Junction Occludin Gene（紧密连接Occludin基因表达）

d 0处理组中除空白培养基对照外OCLN表达较阴性对照显著降低，反映未分化细胞对外界刺激敏感；d 7处理组中，低浓度及低+MFGM CFS处理组OCLN表达显著高于阴性对照，高浓度CFS组则低于对照，MFGM组CFS整体使OCLN表达趋近阴性对照。提示细菌分泌组代谢产物对OCLN具浓度依赖性双向调节，低浓度MFGM诱导菌株的CFS可显著上调已分化Caco-2细胞occludin表达，有利肠屏障完整性。结论：MFGM经LAB发酵产生的低浓度代谢物可增强分化肠上皮细胞紧密连接occludin mRNA表达，支持肠道屏障维护。

四、讨论与结论总结（翻译CONCLUSION）

研究结果表明MFGM可影响选定益生菌LAB菌株的生长及代谢物产生，部分LAB次生代谢物可使上皮细胞occludin表达显著升高。MFGM有提高L. helveticus、L. rhamnosus、L. amylovorus及L. paracasei（菌株15B、24、32、72A）生长后期血清素产量的趋势；MFGM添加使L. bulgaricus、L. helveticus、L. rhamnosus、L. amylovorus及L. paracasei（菌株3、7、15B、24、25、31B、32、72A）在早和/或晚稳定期EPS产量显著增加；L. helveticus（4A）与L. amylolyticus（4B）在MFGM存在时表现抑菌反应。Caco-2细胞经CFS处理后无有害效应——SI与DPPIV检测与阴性对照相似，d 7低、中及高+MFGM CFS处理组ALP活性有高于阴性对照的趋势；d 7低及低+MFGM CFS处理组OCLN表达显著升高。部分益生菌在MFGM存在下产血清素和EPS的提升现象支持将MFGM作为功能性配料与LAB联用以维护肠细胞稳态进而促进人体健康。这表明MFGM作为乳制品中功能性配料与LAB组合应用以增强人体健康的潜在新方向，未来需通过机制研究阐明MFGM诱导上述效应的细菌及肠细胞信号通路，并开展加工应用研究以实现其在乳制品中的实际添加。