哺乳期荷斯坦奶牛尿液性状的参考区间及变异性

《Journal of Dairy Science》：Reference intervals and variability of urinary traits in lactating Holstein cows

　　

监测尿液成分可为评估动物健康、生理状态、营养缺乏以及潜在肾功能不全提供有价值的信息。尽管24 h总尿收集被视为金标准，但由于畜舍条件、收集装置以及动物应激等因素，其在商业养殖条件下的应用并不现实。随机尿样采集（spot urine sampling）是一种可行的替代方案；然而，为消除此类个体间变异，需对尿液浓度进行归一化（normalization），例如以尿比重（specific gravity, SG）作为替代指标。该研究旨在：（i）建立临床健康哺乳期荷斯坦奶牛尿液性状的参考区间（reference intervals）；（ii）评估泌乳阶段（lactation stage）和胎次（parity）对尿液性状变异性的影响；（iii）评估尿液性状与乳性状（milk traits）之间的关联。研究人员在意大利北部17个牧场采集了1,271头奶牛的随机尿液和乳样。尿液pH、尿比重、尿素（urea）、蛋白质（protein）、肌酐（creatinine）、尿囊素（allantoin）、尿酸（uric acid）、葡萄糖（glucose）以及蛋白/肌酐比值（protein-to-creatinine ratio）采用参考方法测定，乳成分则采用红外光谱法（infrared spectroscopy）和流式细胞术（flow cytometry）分析。研究人员使用广义线性混合模型（generalized linear mixed models, GLMM），以尿比重为协变量（covariate），以胎次和泌乳阶段为固定效应（fixed effects），以 herd-test-date（HTD）为随机效应（random effect），评估尿液性状的变异来源，并计算尿液性状之间以及尿液与乳性状之间的Pearson相关系数（Pearson correlations）。研究通过计算2.5^th至97.5^th百分位数（95% CI）建立了所有被调查尿液性状的参考区间。尿素是主要的含氮化合物（nitrogenous compound），其次为尿囊素、肌酐和尿酸。尿液性状表现出广泛的表型变异（phenotypic variation），其中蛋白/肌酐比值变异性最大，而pH和尿比重变异最小。尿比重受泌乳阶段和胎次的显著影响，并解释了大部分尿液性状的变异，支持其用于校正尿液稀释差异的实用性。泌乳阶段影响除pH和尿酸外的所有尿液性状，而胎次仅显著影响肌酐浓度。尿液浓度和大多数含氮化合物在泌乳早期达到最高水平，并在整个泌乳期呈现不同的时间变化模式。HTD解释了相当大比例的变异，尤其对尿pH和尿素浓度而言。尿液含氮化合物之间存在较强的相关性，而尿液与乳性状之间的关联总体较弱；乳尿素浓度与尿液总氮（total N）和尿素表现出最强的正相关。本研究结果为哺乳期荷斯坦奶牛尿液性状提供了全面的参考区间，并识别了关键变异来源，为随机尿样在诊断和牧场管理中的应用奠定了基础。

研究背景与目的

在哺乳动物中，尿液是肾脏滤过活动产生的代谢废物溶液，其成分可反映机体的代谢、消化状态及肾功能。尽管24 h总尿收集被视为评估尿液组成的金标准，但受畜舍条件、收集装置及动物应激等限制，在商业牧场日常应用中并不可行。随机尿样采集虽具可行性，但需对尿液浓度进行归一化处理以消除个体间稀释差异，其中尿比重（specific gravity, SG）被认为是渗透压（osmolality）的最佳替代指标。此前的研究多基于小规模样本或异质试验条件，缺乏针对临床健康哺乳期荷斯坦奶牛尿液性状的大规模参考区间。因此，研究人员利用意大利北部17个集约化牧场的1,271头荷斯坦奶牛，旨在建立尿液性状的参考区间，评估泌乳阶段（lactation stage）和胎次（parity）对尿液性状变异性的影响，并分析尿液性状与乳性状之间的关联。该研究成果发表在《Journal of Dairy Science》。

关键技术方法

研究于2023年4月至11月在意大利北部17个商业牧场开展，随机采样，每头牛仅采样一次。采集清晨奶样及挤奶后1 h内随机尿液样本，4°C保存后运至实验室。尿液pH用pH计测定；总氮（total N）采用Dumas燃烧法；尿素、蛋白质和葡萄糖用COBAS C303生化分析仪测定；肌酐、尿囊素和尿酸采用反相高效液相色谱法（reverse phase-HPLC, RP-HPLC）；尿比重用折射仪测定；蛋白/肌酐比值经计算获得。乳成分用CombiFoss 7红外光谱仪测定，体细胞计数（somatic cell count, SCC）和差异性体细胞计数（differential somatic cell count, DSCC）采用流式细胞术。统计分析使用R软件的广义线性混合模型（generalized linear mixed model, GLMM），以尿比重为协变量、胎次和泌乳阶段为固定效应、herd-test-date（HTD）为随机效应，并采用Pearson相关分析和2.5至97.5百分位数（95% CI）建立参考区间。

研究结果

描述性统计　最终数据集包含1,204头奶牛，平均泌乳日数（days in milk, DIM）为182 d，平均日产奶量为36.2 kg，乳脂、乳蛋白和酪蛋白分别为3.72%、3.39%和2.68%。尿液平均pH为7.99，尿比重为1.026，总氮平均为0.68%，尿素是主要的含氮化合物（平均1,106 mg/dL），其次为尿囊素（302 mg/dL）、肌酐（49.7 mg/dL）和尿酸（21.4 mg/dL）。约77.7%的尿样中检测不到葡萄糖（<0.1 mmol/L），仅有2个样本葡萄糖浓度为0.3 mmol/L。

尿液性状的表型变异性　尿比重受泌乳阶段和胎次的显著影响。将尿比重作为协变量后，其对所有尿液性状的变异均具有显著解释力。泌乳阶段显著影响除pH和尿酸外的所有性状，胎次仅对肌酐浓度有显著影响。尿液浓度在泌乳早期最高，随后下降并在泌乳中后期维持相对稳定；总氮在156–205 DIM达到最高；尿素在泌乳早期最低，随后趋于稳定；蛋白质和肌酐在泌乳早期最高，之后下降；尿囊素在泌乳早期最高、泌乳末期最低；蛋白/肌酐比值在56–105 DIM最高。HTD解释了较大比例的变异，尤其是pH（61.3%）和尿素（53.7%）。

尿液性状之间及尿液与乳性状之间的相关性　尿液含氮化合物之间存在较强的正相关，其中总氮与尿素相关性最高（r=0.89），肌酐与尿囊素之间相关性较强（r=0.75）。尿液性状与乳性状之间的相关性总体较弱，乳尿素含量与尿液总氮（r=0.49）和尿素（r=0.60）呈最强正相关。尿液葡萄糖的存在与尿液浓度及多数含氮化合物浓度的升高显著相关，但与乳性状无显著关联。

讨论与结论

研究建立的大规模参考区间为临床健康哺乳期荷斯坦奶牛的尿液性状提供了基线数据。尿比重作为尿液浓度的衡量指标，解释了各性状变异的显著比例，突显了其在随机尿样分析中的校正价值。泌乳阶段是多数尿液性状变异的重要来源，反映了泌乳早期能量负平衡和蛋白质动员等代谢适应；而胎次的影响较小。HTD解释了较大比例的变异，提示饲料组成、热应激等管理和环境因素对尿液性状具有显著影响。尿液与乳性状之间总体较弱的关联表明，尿液指标具有独立于乳指标的诊断价值。

研究结论指出，通过分析1,000余份随机尿样，研究建立了哺乳期荷斯坦奶牛尿液性状的参考区间，并评估了泌乳阶段和胎次对其变异性的影响，同时分析了尿液与乳性状之间的关联。尿比重可解释大部分尿液性状变异，支持其用于校正尿液浓度的价值。泌乳阶段对参考区间具有显著影响，尤其在泌乳早期变化最为明显。HTD对变异，特别是尿pH和尿素浓度变异，贡献显著，可能反映了日粮和管理因素。这些发现为解释哺乳期奶牛尿液性状提供了稳健基线，并为未来建立特定病理状态的诊断阈值、改善奶牛健康早期检测与监测以及辅助营养管理决策奠定了基础。未来研究应进一步阐明日粮与尿液性状的关系，并考虑季节因素以评估热应激对尿液性状的影响。