表面类型和消毒剂使用对不同营养条件下单核细胞增生李斯特菌生物膜消减的影响

《Journal of Food Protection》：Impact of surface type and sanitizer use on reduction of Listeria monocytogenes biofilms subjected to varying nutrient availability

　　

单核细胞增生李斯特菌（*Listeria monocytogenes*）附着于表面并在低温环境中形成生物膜的能力增加了食品生产加工环境（FPE）中交叉污染的风险。本研究旨在确定哪些食品接触表面（FCS）材料有利于单核细胞增生李斯特菌在营养促进和营养限制条件下的生物膜形成与存活。研究还探讨了三种消毒剂（5%乳酸、200 ppm氯、200 ppm季铵盐化合物）对两种营养环境下形成生物膜的抗菌效果。研究人员使用在胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中培养的五菌株混合培养物，在四种不同FCS试片（1×1 cm）上培养生物膜：聚甲醛（乙缩醛）、腈橡胶、硅橡胶和不锈钢。在营养促进条件下，试片经72小时孵育，每24小时更换TSB，随后进行消毒剂处理。营养限制条件下的试片在最初3天孵育期后，于4.4°C无营养条件下额外存放14天，随后进行处理。结果表明，在营养促进条件下，所有表面类型的生物膜相关细胞群均超过6.75 log CFU/cm²。营养限制条件导致所有表面类型的微生物群减少至6.21-6.48 log CFU/cm²。虽然消毒剂效果依赖于表面类型，但在两种条件下，所有消毒剂与对照组相比均实现了显著消减（P<0.05）。乳酸在两种条件下均 consistently 产生更大消减（P<0.05）。该研究证实了单核细胞增生李斯特菌能够附着在FPE中使用的多种食品接触表面上并形成生物膜，在营养耗尽环境中存活，并提示消毒剂对生物膜的效果可能依赖于作为底物的表面类型。

该研究聚焦于单核细胞增生李斯特菌在食品生产加工环境中的持久性问题，探讨了表面类型、营养条件及消毒剂对其生物膜形成与存活的影响，研究成果发表于《Journal of Food Protection》。单核细胞增生李斯特菌是一种重要的食源性病原体，可引起威胁生命的李斯特菌病，尤其对孕妇及其胎儿、老年人和免疫功能低下人群危害严重。该菌在自然界中广泛存在，能通过原材料、设备或人员活动进入食品生产加工环境，并可在低温、酸性、高盐及低营养等食品加工相关胁迫条件下存活，甚至持续生长。生物膜是由微生物群落嵌入胞外聚合物（EPS）基质中并附着于固体表面的结构，这一适应性特征使微生物能在恶劣环境中存活。在食品生产加工环境中，pH、温度和营养可利用度等因素可触发细菌从浮游态向固着态的表型转变，而胞外聚合物基质不仅稳定生物膜结构，还通过阻碍抗菌剂的扩散贡献于抗菌耐药性，使得生物膜内细菌对消毒剂的敏感性显著降低。鉴于不同食品接触表面在组成上存在差异，可能支持不同程度的生物膜形成，且消毒剂对生物膜的效果可能受表面类型影响，研究人员开展了此项研究，以明确不同表面类型对生物膜形成和存活的相对影响，并评估三种常用消毒剂在不同营养条件下对生物膜的抗菌效果。

本研究使用的菌株来源于美国威斯康星大学麦迪逊分校食品研究所的食品分离株，涵盖多种血清型。研究人员采用的主要关键技术方法包括：利用结晶紫结合试验（Crystal Violet Binding Assay）定量评估各菌株的生物膜形成能力；选用聚甲醛（乙缩醛）、腈橡胶、硅橡胶和不锈钢四种食品接触表面材料制备1×1 cm试片，经清洗、乙醇处理和高压灭菌后进行实验；配制5%乳酸、200 ppm游离有效氯和200 ppm季铵盐化合物三种消毒剂溶液；通过72小时37°C孵育（每24小时更换TSB以模拟营养促进条件）及后续14天4.4°C无营养存放（模拟营养限制条件）建立生物膜模型；采用Dey-Engley中和肉汤终止抗菌活性，结合无菌接种环刮取和涡旋振荡进行细胞脱附，通过系列稀释和平板计数法进行活菌计数；运用双因素方差分析（Two-way ANOVA）结合Dunnett多重比较检验，以及单因素方差分析（One-way ANOVA）结合Tukey多重比较检验进行统计分析。

研究结果部分，生物膜形成能力定量结果显示，依据OD₅₇₀吸光度值分类，五株单核细胞增生李斯特菌中，菌株D为弱生物膜形成者，菌株A、B、C、E为中等生物膜形成者，所有受试菌株均具有生物膜形成能力。

营养促进条件下生物膜计数结果显示，接种后第3天，所有表面类型的生物膜相关细胞群均超过6.75 log CFU/cm²。消毒剂效果受表面类型影响，双因素方差分析表明表面类型与消毒剂之间存在显著交互作用（P=0.0020）。与阴性对照（无处理）相比，所有消毒剂均产生显著消减（P<0.05）：在乙缩醛上，乳酸、氯和季铵盐化合物分别消减3.37、1.92和1.91 log CFU/cm²；在腈橡胶上，分别为2.51、1.97和1.41 log CFU/cm²；在硅橡胶上，分别为3.12、4.22和3.65 log CFU/cm²；在不锈钢上，分别为3.76、1.68和1.68 log CFU/cm²。水单独处理在各表面上的消减均不显著（0.53、0.60、0.97和1.05 log CFU/cm²）。乳酸在不锈钢上的消减显著优于其他消毒剂，在腈橡胶上显著优于季铵盐化合物。

营养限制条件下生物膜计数结果显示，与营养促进条件相比，营养限制条件导致各表面微生物群减少，第17天阴性对照的微生物群分别为：乙缩醛6.35、腈橡胶6.21、硅橡胶6.48、不锈钢6.48 log CFU/cm²。水在各表面上与阴性对照无显著差异。乳酸在乙缩醛、腈橡胶、硅橡胶和不锈钢上分别消减4.56、2.76、5.28和5.04 log CFU/cm²；氯分别为2.42、1.41、4.48和2.79 log CFU/cm²；季铵盐化合物分别为1.74、1.31、4.00和3.10 log CFU/cm²。营养限制条件下乳酸在所有表面上的消减幅度均大于营养促进条件；氯和季铵盐化合物在硅橡胶和不锈钢上的消减幅度也大于营养促进条件。

讨论部分，研究人员指出生物膜在食品接触表面上可通过细胞脱附交叉污染食品，构成重大食品安全风险。研究证实单核细胞增生李斯特菌能定植于四种常见食品接触表面，且在营养限制条件下可存活14天，尽管种群数量略低于营养促进条件，但从生物学角度差异较小。这表明该菌可通过进入固着态并在生物膜内定植来应对恶劣环境。生物膜形成和存活受多种因素影响，包括血清型、生长温度、营养可利用度、表面类型及消毒剂作用。本研究在37°C丰富营养条件下，各血清型菌株均表现出生物膜形成能力，这与某些研究认为血清型与生物膜形成无一致关系的结论相符。选择37°C是为了模拟污染菌进入食品生产加工环境的情况（如来自污染胴体、组织材料或工作人员），并确保生物膜的充分生长。随后的4.4°C存放模拟了食品生产加工环境的实际条件。

关于营养条件的影响，虽然部分研究表明最小培养基可刺激更强的生物膜产生，但本研究选用营养丰富培养基以确保生物膜形成。营养限制条件下生物膜持续存活14天的能力，反映了食品生产加工环境中常见的非生产期设备存放、低温和非食品接触表面偶然接触营养源后未被及时清洁等实际情况，这对防控单核细胞增生李斯特菌构成挑战。表面材料方面，虽然表面疏水性和细菌表面疏水性可能影响生物膜形成，但本研究结果显示各表面类型上生物膜种群数量相似，表明表面疏水性可能并非生物膜形成程度的唯一决定因素，需进一步通过显微镜等定性分析验证。

消毒剂效果评估是本研究的核心内容之一。乳酸在多数情况下实现了超过3 log CFU/cm²的理想消减，尤其在营养限制条件下于乙缩醛（4.56 log）和不锈钢（5.04 log）上表现突出。尽管乳酸因腐蚀性而不常单独作为消毒剂使用，但其效果值得进一步研究，包括与其他消毒剂联用、稀释使用或用于耐乳酸表面。值得注意的是，营养限制条件下硅橡胶上所有消毒剂均达到≥4 log消减，这与部分研究认为橡胶难以清洁的结论形成对比，提示营养限制条件可能增强单核细胞增生李斯特菌对某些表面消毒剂的敏感性。然而，氯和季铵盐化合物在腈橡胶上未产生显著消减，在乙缩醛上与水的消减效果相似，表明消毒剂效果确实受表面类型和 environmental conditions 的复杂影响。

研究人员也指出了本研究的局限性：采用单种多菌株生物膜而非多物种混合生物膜，未能代表食品生产加工环境中生物膜的全部复杂性；未考虑磨损表面和有机残留物存在的情况；消毒剂应用方式未模拟实际清洁过程中的动态机械力；未确定生物膜形成后各菌株的相对比例，无法排除优势菌株对结果的潜在影响。未来研究应聚焦于强生物膜形成菌株的鉴定，以及与其他相关腐败微生物的共培养实验。

研究结论部分翻译如下："本研究结果表明，单核细胞增生李斯特菌能够附着于食品生产加工环境中使用的多种食品接触表面并形成生物膜。生长温度和营养丰富性等因素影响生物膜形成程度。来源于营养丰富环境并转移至营养耗尽环境的单核细胞增生李斯特菌生物膜能够存活并相对维持种群数量达14天。消毒剂的应用在各表面类型上均产生了生物膜消减。与阴性对照（无处理）相比，所有消毒剂均有效（P≤0.05）降低了生物膜，而单独用水处理则无效（P>0.05）。乳酸有时比氯和季铵盐化合物更有效。即食食品中近期单核细胞增生李斯特菌暴发的案例突显了该菌对食品生产者构成的挑战。针对营养可利用度、表面类型和消毒剂使用之间相互作用的研究，为理解单核细胞增生李斯特菌在食品生产加工环境中的行为和生态提供了宝贵见解。具体而言，本研究证实了单核细胞增生李斯特菌能在多种营养条件和多种表面类型上存活；表明消毒剂效果可能依赖于表面类型；并证明如果正确施用，各种消毒干预措施仍然有效。对更多表面、消毒剂和单核细胞增生李斯特菌菌株的进一步测试，将有助于更深入地阐明单核细胞增生李斯特菌的行为。"