基于剪切与磁场诱导组装实现细胞定位的层状磁活性水凝胶的工程化构建

《Advanced Materials》：Engineering Layered Magnetic Hydrogels for Cell Placement via Shear and Magnetic Field-Induced Assembly

　　

水凝胶基人工组织的设计若要实现可逆、程序化且复杂的运动，需同时具备刺激响应性与结构各向异性。本研究通过两种不同途径，将磁性颗粒悬浮液结构化为层状结构，从而在生物相容性水凝胶中生成非单向各向异性：其一为对静态样品施加非稳态磁场；其二为在稳态剪切流上叠加稳态磁场。在两种方法中，磁性颗粒均在随后发生凝胶化的聚合物基质内发生定向自组装，从而保留所形成的结构。研究人员分析了组装动力学，表征了所得层状图案，并为每种方法构建了相图。层状结构的形貌与周期性被证明强烈依赖于几何约束，使得层间间距可从数十微米调至数百微米。至关重要的是，研究表明所得层状水凝胶能够将人成纤维细胞限制在相邻的富颗粒层之间，在7天培养期内维持细胞存活率高于95%，并促进细胞优先沿平行于层状结构的方向排列。这些发现确立了磁场导向层状结构化为具有可编程内部结构的各向异性水凝胶提供了一条多功能途径，为组织工程、生物驱动和软体机器人领域开辟了新的机遇。

本研究聚焦于层状磁活性水凝胶的工程化构建及其在细胞定位中的应用，发表于《Advanced Materials》期刊。生物组织在分子至宏观尺度上呈现层级化、各向异性的复合结构，这种内在各向异性是其诸多宏观特性的基础，对生物体的复杂功能至关重要。例如，骨骼肌通过多尺度取向纤维结构表现单向各向异性，而关节软骨则呈现双向各向异性，其多层胶原纤维网络在不同深度具有不同的取向模式——表层纤维平行于表面且相互正交以提供剪切抗性，中间层纤维随机取向以增强抗压强度，深层纤维呈交叉图案以优化承重能力。然而，传统水凝胶多为各向同性和均质结构，难以模拟天然组织的方向性和层级化组织特征，在需要定向细胞架构和长程有序性的应用场景中受限明显。在工程化水凝胶中重现这种各向异性已成为核心目标，现有策略包括取向聚合物链、创建单向通道状空隙或在预聚液中排列纳米填料等，通常借助机械力（剪切、拉伸或压缩）或矢量场（电场或磁场）等定向刺激来诱导结构。其中，磁场因其非接触、非侵入性特点及均匀穿透能力而尤为突出，可用于制备宏观厚度大、排列规整的水凝胶。

尽管单向各向异性水凝胶的制备已相对成熟，但具有更复杂结构取向的水凝胶构建仍具挑战，需要分步磁排列和聚合步骤。研究人员探索了两种制备层状结构的新途径：一是对静态样品施加高频扰动磁场（field-induced assembly），二是叠加稳态剪切流与沿速度梯度方向的单轴稳态磁场（shear-induced assembly）。在两种途径中，磁性颗粒均在凝胶化聚合物基质内发生定向自组装，聚合后层状结构被固定于水凝胶网络中，可作为细胞定位的支架。这两种途径虽然均产生层状结构，但其吸引力物理起源根本不同：场致情形源于快速变化磁场下的时间平均偶极相互作用，而剪切诱导情形则源于场致组装链在流场驱动下的倾斜。

研究人员分析了两种组装途径的动力学特性，构建了结构相图，并系统研究了层状结构的周期性调控规律。对于场致组装，通过三轴磁场发生器施加由稳态分量与正交振荡分量叠加而成的高频扰动磁场；对于剪切诱导组装，使用商业扭转载流变仪在板-板几何中施加剪切流，同时通过环绕线圈施加与速度梯度方向对齐的单轴稳态磁场。两种情况下均以Mason数（Mn）为关键控制参数，但其定义因流体动力来源不同而有所区别。场致Mason数（Mn_f）量化扰动场中流体动力与磁静力之比，剪切诱导Mason数（Mn_s）则反映剪切流与磁场的竞争。研究人员通过粒子级模拟和实验测量相结合的方法，表征了组装过程中的聚簇动力学、层状图案的形成与演化，并详细分析了层状结构对几何约束（样品高度h）的依赖关系。

为验证层状水凝胶的生物应用潜力，研究人员将人成纤维细胞（HFs）引入两种组装体系。场致途径采用氧化昆布多糖-明胶复合水凝胶，通过动态共价亚胺（Schiff碱）键形成实现快速、细胞相容的交联；剪切诱导途径则采用物理明胶水凝胶，通过降温至凝胶化阈值以下促进聚合物链的物理交联。细胞存活率检测显示，在典型处理条件下，扰动磁场（1–100 Hz）或剪切流暴露后成纤维细胞存活率无明显下降。在长程培养实验中，层状水凝胶中细胞7天存活率保持在95%以上，且层状结构在培养期间保持稳定。细胞形态学分析表明，层状水凝胶Print诱导的细胞定向排列显著，细胞优先沿平行于层状结构的方向取向生长，而对照组呈各向同性分布。

研究结论指出，磁场诱导合成是一种无需模板、多功能的各向异性水凝胶制备策略。磁响应性水凝胶不仅可作为组织良好的三维支架复制天然组织的复杂结构，还能实现远程磁机械刺激以调控细胞行为，兼具结构各向异性与动态功能性。与逐层堆叠细胞片的传统方法相比，本研究通过结构化磁悬浮液提供了更直接的层状结构构建途径。两种组装方法均能实现磁颗粒在凝胶化聚合物基质内的定向自组装，聚合后层状结构被固定并作为细胞定位支架，同时保持高细胞存活率。粒子浓度和几何约束对层形成及其周期性有关键影响，受限细胞优先平行于磁层排列，呈现显著的组织各向异性。层状结构不仅引导细胞定位，还产生了区别于非结构化对照组的独特力学响应。

本研究的技术方法主要包括：三轴磁场发生与成像系统（场致组装，自制线圈组配合高速摄像）及商业化扭转载流变仪与光学显微系统（剪切诱导组装）；碳基铁颗粒（BASF EW级，平均直径3.5 μm）在甘油-水混合载液中的磁悬浮液制备；基于氧化昆布多糖-明胶动态共价交联（场致）或明胶物理交联（剪切诱导）的水凝胶体系；人成纤维细胞的三维封装与活/死染色评价；以及层状结构周期性的一维对关联函数（g(r)）分析。样本队列为商业化人成纤维细胞系，来源于Virgen de las Nieves大学医院细胞生产与组织工程单元。

在场致组装方面，研究人员详细分析了扰动磁场下的相互作用势能。当Mn_f足够大时，颗粒无法跟随瞬时场矢量，经历有效的时间平均相互作用。在对数响应区内，经一个场周期平均的偶极对势能在特定取向产生面内吸引和面外排斥，促进层状结构形成。在"魔角"θ_p = θ_m = 54.7°时，相互作用在磁场平面内完全各向同性。动态标度理论（Dynamic Scaling Theory, DST）分析表明，不同扰动角θ_p下的聚簇动力学可塌缩到主曲线上，确认早期组装动力学的角度无关性，提取的动力学指数z ~ 0.7与以往稳态场和旋转场研究一致。相图揭示了三个主要结构区域：低θ_p时的平行链、中间角度区的层状结构（低浓度下为碎片状，高浓度下完全渗透），以及高θ_p时的正交链。层状周期性对样品高度h呈~ h^0.4的幂律依赖，这一亚线性约束依赖性与剪切诱导途径中的近似线性 scaling 形成鲜明对比。

在剪切诱导组装方面，研究人员分析了剪切-磁场叠加下的链间相互作用。当Mn_s增加时，剪切流使场致组装链向流动方向倾斜，改变了链间相互作用的性质；链间侧向排斥减弱甚至变为吸引，驱动其聚集成与流动方向对齐的延伸层。粒子级模拟揭示了随Mn_s变化的三种组装区域：低剪切区（Mn_s = 0.025）链旋转合并为薄层；中间剪切区（Mn_s = 0.25和2.5）链部分断裂后快速重组为层；高剪切区（Mn_s = 25）链完全分离形成厚的无序"液态层"。稳定层状结构实验观测于Mn_s ? 1时出现，相图显示Mn_s < 0.01时为场对齐链、0.01 < Mn_s < 4时为不稳定薄层、Mn_s ? 4时为厚稳定层。临界层形成Mason数Mnc-l随间隙高度增加而降低，表明真正控制层化起始的参数并非单独的Mn_s，而是与Mn_s·h²成正比的链倾斜角。层状周期性随h呈接近1次幂的幂律增长，这与Cutillas等的磁静力模型（预测~ h^0.5）以及Morillas等的链倾斜模型（预测线性scaling）进行了比较验证。

在细胞约束应用方面，场致途径被选为生物学相关平台，因其无需快速降温和流变仪操作条件，更适合长期细胞培养。层间间距可通过样品高度编程调控，从共聚焦堆栈的一维对关联分析证实，颗粒富集带和细胞分布区呈现互补周期性，增大样品间隙导致细胞图案结构周期性相应增加。在最大层间间距时，细胞分布周期性减弱，与较弱的几何约束一致。层状颗粒结构还改变了水凝胶的力学响应：对比测量显示，含层状结构水凝胶的宏观力学响应明显区别于裸水凝胶和随机分布颗粒水凝胶。

长期培养评估中，场致层状水凝胶和无颗粒对照组的细胞7天存活率均高于95%。结构稳定性监测显示，层状架构在7天内保持完整，后期出现轻微层弯曲但无颗粒泄漏。细胞取向分析表明，结构化后即刻细胞呈圆形、分布各向同性；7天后对照组仍各向同性，而层状水凝胶中细胞呈现强烈的平行于层状结构的排列峰，证实磁支架建立的各向异性引导了细胞沿设定优选方向生长。这一定向排列对复制结构各向异性组织具有重要 relevance。

讨论部分进一步比较了两种组装策略的优劣。与光基方法（在致密或光散射基质中穿透受限）和电场方法（受生理介质中离子屏蔽影响）相比，磁场可远程施加并深入水相体系，特别适用于体积结构化。场致途径无需光引发剂或喷嘴挤出，可直接形成能够容纳细胞的层间空间。然而，剪切诱导途径仍需克服温度和无菌性约束。层状颗粒结构对水凝胶宏观力学响应的显著影响，进一步支持了内部组织在这些材料中的 relevant性。研究人员指出，系统分析层间间距如何调控长期细胞反应仍是未来工作的重要方向。

研究结论部分翻译如下：磁场诱导合成代表了一种无需模板且多功能的各向异性水凝胶制备策略。这些磁响应性水凝胶不仅可作为组织良好的三维支架复制天然组织的复杂结构，还能实现远程磁机械刺激以在外加磁场下调控细胞行为。因此，它们为先进组织工程应用同时提供了结构各向异性和动态功能性。虽然单向各向异性水凝胶的制备已相对成熟，但由于需要顺序磁排列和聚合步骤来实现复杂结构，层状水凝胶的构建仍具挑战性。以往研究通过堆叠单个细胞片成功实现了三维结构，但本研究通过结构化磁悬浮液提供了更直接的途径。在此工作中，研究人员展示了两种使用磁悬浮液作为支架材料制备层状结构的不同方法：一是对静态样品施加高频扰动场，二是叠加稳态剪切流和沿速度梯度方向的单轴稳态磁场。在两种情况下，磁颗粒均在凝胶化聚合物基质内发生定向自组装。聚合后，所得层状结构固定于水凝胶网络中，作为细胞定位支架，同时在所研究的条件下保持高成纤维细胞存活率。研究发现强调了粒子浓度和几何约束对层形成及其周期性的关键影响。此外，随时间评估的细胞形态学显示，受限细胞优先平行于磁层排列，表现出与复制结构各向异性组织相关的显著组织各向异性。系统分析层间间距如何调节长期细胞反应仍是重要的下一步工作。层状结构不仅引导细胞定位，而且相对于非结构化对照产生独特的力学响应，进一步支持了这些材料中内部组织的 relevant性。