《Advanced Materials Interfaces》：CPP–PEG-Guided Surface Engineering of Mitochondria Enables Efficient Cellular Uptake and Respiratory Modulation
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线粒体移植已成为调控线粒体功能障碍中细胞生物能量学的一种有前景策略。然而，分离线粒体存在稳定性差和细胞摄取有限的问题，限制了其治疗应用。为解决这些局限性，研究人员开发了一种表面工程策略，在稳定分离线粒体的同时使其能够与靶细胞发生相互作用，并为选择性的器官及细胞
线粒体移植已成为调控线粒体功能障碍中细胞生物能量学的一种有前景策略。然而，分离线粒体存在稳定性差和细胞摄取有限的问题，限制了其治疗应用。为解决这些局限性，研究人员开发了一种表面工程策略，在稳定分离线粒体的同时使其能够与靶细胞发生相互作用，并为选择性的器官及细胞靶向提供平台。研究人员将带有脂质/碳链的聚乙二醇（PEG）引入线粒体相关膜结构，在其表面形成保护性水化层。该PEG层还可作为一种模块化功能化平台，与肽和抗体等生物分子偶联，从而拓展其生物医学应用。在本研究中，研究人员考察了能否利用经马来酰亚胺连接（maleimide linkage）并接枝细胞穿透肽（CPP）的PEG屏蔽线粒体，调控靶细胞中的线粒体功能。结果提示，CPP-PEG修饰线粒体表现出高效的细胞内化，并与线粒体呼吸活性升高相关，这与细胞内生物能量学调控相一致。这些发现提示，在PEG层末端对CPP进行空间受控呈递，可能是兼顾分离线粒体稳定化与调控细胞内动态行为和功能反应的有效策略。该表面工程策略为线粒体相关工程及未来生物能量学策略提供了概念验证性的设计框架。
该文发表于《Advanced Materials Interfaces》，围绕线粒体移植在生物医学转化中的关键瓶颈展开。线粒体作为细胞能量代谢、应激应答和多种病理过程的核心细胞器，已成为疾病干预的重要靶点。近年来，线粒体移植被视为改善线粒体功能障碍、重建细胞生物能量学状态的潜在治疗手段，尤其在严重心功能障碍等情境中受到关注。然而，现有线粒体移植策略仍存在若干根本性问题：其一，分离线粒体在保存过程中极易发生功能衰减，即便低温条件下也可在短时间内显著丧失活性；其二，外源线粒体进入受体细胞的效率有限，难以稳定实现细胞内功能调控；其三，既往采用细胞穿透肽（CPP）直接修饰线粒体的策略，虽然可能提高摄取，但也可能直接扰动线粒体外膜，进而影响膜完整性与生物能量学功能。因此，如何在不损伤线粒体膜结构的前提下，兼顾稳定性、可修饰性和细胞摄取能力，成为线粒体制剂化与工程化应用的核心科学问题。
基于此，研究人员提出一种模块化的线粒体表面工程框架，将其定义为增强型人工设计线粒体（e-MITO）。该策略借鉴药物递送系统（DDS）中聚乙二醇（PEG）表面修饰与末端配体功能化的设计原则，通过在分离线粒体相关膜结构表面插入带脂质锚定基团的PEG，构建保护性水化层；进一步利用马来酰亚胺化PEG在其末端偶联带正电的八精氨酸类CPP，以实现CPP的远端呈递。该设计的关键思想在于：并非让CPP直接接触线粒体膜，而是借助PEG屏蔽层进行空间隔离，以在尽量保留线粒体膜完整性的同时增强受体细胞摄取。研究结论表明，CPP–PEG引导的表面工程可在不显著损害线粒体ATP生成能力和外膜完整性的基础上，提高线粒体样材料的细胞内化效率，并增强受体HEK细胞的基础呼吸、最大呼吸及备用呼吸能力，提示其具有调控细胞内线粒体呼吸功能的潜力。这项工作的重要意义在于建立了一个化学定义明确、可拓展、可模块化的线粒体制剂工程框架，为未来器官靶向、细胞靶向及线粒体相关治疗制剂的开发提供了新的方法学基础。
研究人员主要采用了以下关键技术方法。研究材料为来源于人HEK细胞的可冻存线粒体富集制剂MRC-Q（mitochondria organelle complex-Q），其并非高度纯化线粒体，而是保留了线粒体相关膜成分的细胞器富集组分。通过DMG-PEG 2000或DMG-PEG 2000（maleimide）与MRC-Q简单混合并离心纯化，构建PEG-Q与CPP-PEG(mal)-Q；采用动态光散射（DLS）与ζ电位分析表征理化性质，采用竞争性酶联免疫吸附测定（ELISA）定量PEG负载；以荧光素酶-荧光素（luciferin–luciferase）发光法检测ATP生成，以细胞色素C氧化酶试剂盒评估线粒体外膜完整性；在HEK受体细胞中，使用Seahorse XFp细胞外通量分析仪检测氧耗率（OCR），并结合流式细胞术与共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析细胞摄取与胞内定位。
3.1 MRC-Q表面的PEG化修饰
研究人员首先通过简单的混合-离心流程在线粒体表面实施PEG化修饰。实验所用MRC-Q平均粒径约为900 nm，表面呈负电性。引入DMG-PEG 2000后，所得PEG-Q的表观粒径下降，表面负电荷减弱。研究人员据此认为，PEG在这些线粒体相关膜结构表面形成了水化层，改善了悬液中的胶体分散性，并抑制了聚集，因此在动态光散射（DLS）测量中显示出更小的流体力学粒径。这一结果说明PEG表面工程在理化层面确实改变了MRC-Q的分散状态与表面性质。
3.2 PEG负载量及PEG修饰后线粒体功能评价
为确认PEG是否成功结合于MRC-Q，研究人员采用ELISA检测线粒体相关样品中的PEG信号。结果显示，PEG-Q中可检测到明确的PEG，按质量换算约占线粒体蛋白的1%（w/w），支持PEG成功结合于MRC-Q制剂。随后，研究人员进一步评价PEG修饰是否影响线粒体核心功能。结果表明，PEG-Q的ATP生成能力与未修饰MRC-Q相比无统计学显著差异，且外膜完整性保持不变。由此可见，在当前PEG接枝密度下，PEG表面工程未明显损伤线粒体能量代谢功能和外膜结构，说明该修饰方式具有较好的温和性与相容性。
3.3 PEG-Q的肽修饰及肽/PEG双重修饰后的线粒体功能
在获得PEG修饰线粒体后，研究人员进一步将带有FAM标记的CPP通过马来酰亚胺官能团共价连接至PEG末端，构建CPP-PEG(mal)-Q。结果显示，与PEG(mal)-Q相比，CPP-PEG(mal)-Q的粒径增加，表面电位进一步向中性靠近，这与带正电CPP成功偶联后的预期一致。在线粒体功能方面，CPP-PEG(mal)-Q的ATP生成量虽较MRC-Q和PEG(mal)-Q略低，但总体仍得到保留；更关键的是，其外膜完整性未见明显破坏。该结果支持了研究设计的核心假设，即PEG屏蔽层能够在保留线粒体外膜结构的前提下，实现CPP的安全展示，避免直接肽-膜作用导致的膜扰动。
3.4 CPP-PEG(mal)-Q处理后HEK细胞的线粒体功能分析
为判断工程化线粒体是否能够真正影响受体细胞生物能量学，研究人员将CPP-PEG(mal)-Q加入HEK细胞，并于24 h后通过Seahorse XFp检测氧耗率（OCR）。结果显示，与未处理组和MRC-Q组相比，CPP-PEG(mal)-Q处理组在基础呼吸、最大呼吸及备用呼吸能力方面均显著升高，而MRC-Q组与未处理组相近，未显示明显呼吸增强。这说明，单纯添加未修饰线粒体并不足以在该条件下提升受体细胞呼吸活性，而经CPP–PEG表面工程处理后的线粒体相关材料则与更强的线粒体呼吸调控相关。研究人员据此认定，CPP-PEG(mal)-Q在促进细胞摄取之外，还具有增强细胞内呼吸功能参数的作用。
3.5 CPP-PEG(mal)-Q的细胞摄取分析与胞内观察
为探明呼吸增强是否与细胞摄取效率提高相关，研究人员利用RFP标记线粒体、FAM标记CPP，并通过流式细胞术定量HEK细胞对不同样品的摄取情况。结果显示，CPP-PEG(mal)-Q处理细胞中不仅FAM信号明显存在，RFP信号也显著高于MRC-Q组和PEG-Q组，表明该表面工程显著提高了线粒体相关材料的细胞内化水平。时间过程实验进一步显示，CPP-PEG(mal)-Q的摄取具有时间依赖性，3–6 h时摄取更高。随后，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察到红色线粒体信号与绿色肽信号在胞内呈共定位，合并后形成黄色信号，提示CPP与线粒体相关材料在进入细胞后仍保持关联。结合流式和显微结果，研究人员证明了远端PEG末端呈递CPP确实能够有效促进工程化线粒体材料进入靶细胞。
讨论部分指出，本研究的主要创新在于提出了一种相较于直接肽修饰或无机包裹更为温和、可控且化学定义明确的线粒体表面工程策略。PEG-lipid插入线粒体相关膜结构后所形成的水化层，一方面改善了胶体稳定性并可能减少聚集，另一方面为空间隔离CPP提供了结构基础，从而减轻CPP直接接触脂质双层所导致的膜扰动风险。研究中还引用了前期观察：阳离子肽直接与线粒体孵育可诱导形态破坏，这进一步支持本策略的必要性。相较于既往Pep-1或精氨酸衍生物直接吸附于线粒体外膜的方法，本研究通过马来酰亚胺介导的末端偶联，提高了修饰方式的可控性和可重复性。研究人员同时强调，本文结果应被理解为“与摄取相关的呼吸调控增强”，并非直接证明外源线粒体已稳定整合入宿主线粒体网络，因为摄入材料在胞内仍可能经历加工、降解，释放出的代谢物、蛋白或脂质也可能间接改善宿主细胞生物能量学。此外，研究也指出了局限性，包括仅在同源HEK供受体体系中验证、仅考察一种PEG链长和接枝密度、未评估长期胞内命运与体内分布安全性，以及尚未系统分析抗PEG抗体和加速血液清除等潜在问题。
研究结论部分可译为：总之，本研究提示，基于PEG-lipid插入与受控CPP呈递相结合的CPP–PEG引导表面工程，能够支持分离线粒体相关材料的结构稳定化与功能调控。该策略在维持线粒体结构完整性的同时，促进了细胞摄取并实现了线粒体呼吸调节，从而建立了一种化学定义明确的细胞器制剂化框架。这些发现为PEG引导的线粒体工程提供了合理的设计依据，并可能支持未来开发具有可调生物学性质的线粒体相关治疗制剂。
