银杏叶提取物（GBE）与中长链甘油三酯（MLCT）联合应用较单独处理更能抑制阿尔茨海默病（AD）进展：网络药理学分析与体外实验验证

《Journal of Future Foods》：A combination of Ginkgo biloba leaf extract and medium- and long-chain triglycerides may better inhibit the progression of Alzheimer's disease than individual treatments: Network pharmacology analysis and in vitro experimental validation

　　

银杏叶提取物（GBE）和中长链甘油三酯（MLCT）均具有潜在的认知增强作用，但二者联用是否能增强对阿尔茨海默病（AD）的治疗效果尚不明确。本研究采用网络药理学与体外细胞实验相结合的方法，比较了GBE与MLCT单独及联合处理对AD的治疗效果，并探讨其潜在分子机制。首先，分别采用高效液相色谱-电喷雾-四极杆飞行时间串联质谱（HPLC-ESI-QTOF-MS²）和气相色谱（GC）分析鉴定GBE和MLCT的主要活性成分；随后运用网络药理学方法预测作用靶点，并进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析、基因本体（GO）及京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析；进而通过分子对接和H₂O₂诱导的小鼠海马神经元HT22细胞模型对预测结果进行验证。在GBE中初步鉴定出13种化合物，包括9种黄酮类和4种银杏内酯；MLCT由74.87%中链脂肪酸和24.94%长链脂肪酸组成。网络药理学研究发现核心靶点与氧化应激和细胞凋亡密切相关。细胞实验结果表明，GBE与MLCT能够显著改善H₂O₂诱导的HT22细胞氧化应激并降低细胞凋亡率，与网络药理学预测结果一致。通过网络药理学、分子对接及细胞实验，研究人员确认GBE与MLCT联合应用可通过减轻氧化应激和抑制细胞凋亡来延缓AD进展，为植物活性成分与结构性脂质在功能性食品或药品开发中的联合应用提供了理论基础。

阿尔茨海默病（AD）是一种以认知障碍和记忆衰退为主要特征的神经退行性疾病，其关键病理特征包括β样淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成的神经毒性斑块，以及异常磷酸化tau蛋白形成的神经纤维缠结（NFTs），二者最终导致神经元死亡与信号传导障碍。目前临床采用的药物治疗、免疫治疗及基因工程等方法疗效有限且伴随明显不良反应，因此寻找安全有效的干预策略仍是重大研究挑战。传统中医药（TCM）及药食同源植物（MEHP）因具有多成分、多靶点、多通路且副作用小等优势而受到广泛关注。银杏叶提取物（GBE）中的主要活性成分为萜类（银杏内酯A/B/C和银杏内酯）和黄酮类（槲皮素、山柰酚、异鼠李素等），这些成分可透过血脑屏障（BBB）在脑内达到有效浓度，发挥抗氧化、抑制乙酰胆碱酯酶活性及降低Aβ水平等作用。另一方面，脂质代谢紊乱与AD发生发展密切相关。中链甘油三酯（MCT）可通过生酮作用为脑组织提供能量，而不饱和长链脂肪酸（ULCFA）则具有抗氧化、抗炎及降低Aβ浓度等效应。中长链甘油三酯（MLCT）是在同一甘油骨架上同时含有中链脂肪酸和不饱和长链脂肪酸的结构性脂质，兼具快速生酮和补充必需脂肪酸的优势。尽管GBE和MLCT各自对AD及认知障碍具有潜在作用，但二者联用是否存在协同治疗效应尚不清楚。因此，本研究旨在系统探讨GBE与MLCT联合干预AD的效果及其分子机制，并将其研究成果发表于《Journal of Future Foods》。

本研究采用网络药理学、分子对接以及体外H₂O₂诱导的HT22细胞氧化应激模型相结合的策略，从活性成分筛选、靶点预测、通路富集、关键成分-靶点互作到细胞功能验证，系统比较了GBE与MLCT单独及联合应用对AD进展的影响。研究得出核心结论：GBE与MLCT联合应用能够较单独处理更有效地通过减轻氧化应激和抑制神经元凋亡来延缓AD进展。该结果为将植物活性成分与功能性结构化脂质相结合、开发用于预防或治疗AD的功能性食品或药品提供了理论依据。

研究采用的主要技术方法如下：利用HPLC-ESI-QTOF-MS²和GC分别解析GBE与MLCT的化学组成；通过Swiss Target Prediction和PharmMapper等数据库预测活性成分靶点，并从OMIM、TTD、GeneCards等六个数据库整合AD相关靶点；借助STRING数据库构建PPI网络，使用Cytoscape进行拓扑分析，并通过DAVID进行GO和KEGG富集分析；利用AutoDock Vina开展关键活性成分与核心靶蛋白的分子对接；以200 μM H₂O₂建立HT22细胞氧化应激模型，通过CCK-8、Calcein AM/PI活死细胞染色、Annexin V-FITC/PI凋亡染色、DCFH-DA荧光探针检测活性氧（ROS），并测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、还原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平；最后采用Western blot检测凋亡及氧化应激通路相关蛋白表达。

研究结果可概括如下。

3.1 GBE与MLCT的主要活性成分。HPLC-ESI-QTOF-MS²在GBE中初步鉴定出13种化合物，包括4种银杏内酯（银杏内酯A/B/C和银杏内酯）和9种黄酮类（(+)-儿茶素、(-)-儿茶素、山柰酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、刺槐素、槲皮素、山柰酚、异鼠李素和木犀草素）。GC分析显示，MLCT主要由74.87%中链脂肪酸和24.94%长链脂肪酸组成，其中辛酸（C8:0，CYA）、癸酸（C10:0，CA）、亚油酸（C18:2，LA）、α-亚麻酸（C18:3，ALA）和二十二碳六烯酸（C22:6，DHA）被选为核心活性成分。

3.2 活性成分治疗AD的潜在靶点。网络药理学分析显示，GBE和MLCT的活性成分分别得到630和394个潜在靶点，去重后获得413个活性成分靶点；从六个AD相关数据库去重后得到4309个AD靶点，二者交集为203个潜在治疗靶点。构建的“药物-活性成分-靶点”网络共包含217个节点和610条边，提示活性成分通过多靶点协同发挥作用。

3.3 PPI网络分析。将交集靶点导入STRING数据库分析蛋白互作，构建包含203个节点和2728条边的PPI网络，平均节点连接度为27。利用CentiScaPe插件筛选出连接度、介度和接近度均高于网络平均值的节点作为核心靶点。

3.4 GO和KEGG富集分析。DAVID富集分析共获得972条GO条目，生物过程主要涉及对外源性刺激的反应、蛋白质磷酸化和信号转导；分子功能集中于蛋白质结合、酪氨酸激酶活性、核受体活性和酶结合；细胞组分主要定位于质膜、受体复合物和神经元胞体等。KEGG分析共获得172条通路，显著富集的前15条通路主要涉及细胞凋亡、PI3K-Akt、MAPK、 FoxO、p53等信号通路。

3.5 成分-靶点-通路网络。网络分析显示，GBE中的黄酮类和MLCT中的不饱和脂肪酸是主要药效基础；PIK3R1、AKT1、MAPK3、HSP90AA1、MMP9和EGFR等蛋白连接度高，与多种活性成分广泛互作，提示GBE和MLCT可通过多靶点调控产生复杂药理效应。

3.6 分子对接验证。对关键活性成分与前15个核心蛋白进行分子对接，大多数靶点结合能低于-5 kcal/mol，部分甚至低于-9 kcal/mol，提示结合活性良好。GBE活性成分与IL6、PTGS2、MAPK3结合能较高，而MLCT脂肪酸成分与HSP90AA1、MAPK3、AKT1结合较好。

3.7 GBE、MSP和H₂O₂对细胞活力的影响。CCK-8实验显示，200 μM H₂O₂使HT22细胞活力下降约50%，被选为最佳造模浓度。MLCT经皂化得到的MLCT皂化产物（MSP）在300 μM以内无显著毒性，GBE在30 μg/mL以内无显著毒性，因而分别被选定为高剂量，并同时设置1/2浓度的低剂量组。

3.8 GBE和MSP对细胞存活率及形态的影响。与模型组相比，低剂量GBE、低剂量MSP及二者联合处理均可提高细胞活力；高剂量MSP单独作用未见显著恢复作用。Calcein AM/PI染色显示，H₂O₂组呈现强红色荧光和细胞皱缩，而各处理组红色荧光明显减弱，其中以低剂量联合组效果最好，提示联合干预具有更强的神经保护作用。

3.9 GBE和MSP对H₂O₂诱导HT22细胞凋亡的影响。Annexin V-FITC/PI染色显示，H₂O₂处理导致细胞出现凋亡和坏死；各干预组均能一定程度减轻凋亡和坏死，低剂量组优于高剂量组，联合给药组较相同剂量单药组抗凋亡效果更佳，低剂量联合组效果最为显著。

3.10 GBE和MSP对H₂O₂诱导ROS含量的影响。DCFH-DA探针检测显示，H₂O₂显著升高HT22细胞内ROS水平；GBE、MSP及各联合处理均能有效降低ROS，且联合组ROS水平低于单药组，提示二者具有协同清除ROS的作用。

3.11 GBE和MSP对细胞内SOD、CAT、GSH和MDA的影响。GBE、MSP及二者联合均能显著升高GSH含量及SOD、CAT活性，且联合组呈现协同增强效应。然而联合用药并未显著协同降低MDA含量，作者认为这可能与脂肪酸进入细胞后作为氧化底物未及时消耗有关。

3.12 联合使用GBE和MSP对氧化应激通路及凋亡相关蛋白表达的影响。Western blot结果显示，H₂O₂降低Bcl-2/Bax比值并升高cleaved caspase-3/caspase-3比值，提示其诱导神经元凋亡；GBE、MSP及联合处理均可显著改善上述指标，联合组效果更为明显。氧化应激通路方面，模型组核蛋白Nrf2表达降低而HO-1、NQO1表达代偿性升高；各处理组显著上调总蛋白及核蛋白中Nrf2水平，同时下调HO-1、NQO1表达。该现象被解释为Nrf2激活后增强了SOD、CAT等抗氧化酶活性，快速清除了ROS，因此下游应激酶无需过度诱导；也可能与不同时程的转录调控、Nrf2半衰期较短以及检测时间窗有关。

讨论部分进一步指出，氧化应激是连接AD多种致病机制的核心环节，过量ROS攻击生物大分子并促进Aβ沉积、tau蛋白过度磷酸化及神经元凋亡。GBE因其可穿越血脑屏障并具有抗氧化能力而被视为AD干预候选物质；MLCT富含的中链脂肪酸可通过β-氧化产生酮体供能，而亚油酸、α-亚麻酸和DHA等长链多不饱和脂肪酸则具有抗炎、抗氧化及维持血脑屏障和突触可塑性等作用。网络药理学筛选的核心靶点包括IL6、AKT1、BCL2、PTGS2、PPARG和MMP9等，涉及炎症、凋亡、氧化应激和能量代谢相关通路。HT22细胞实验进一步证实，GBE与MSP在安全浓度范围内可协同降低ROS、提升抗氧化酶活性、恢复细胞活力和形态，并通过调节Bcl-2/Bax、caspase-3及Nrf2等关键分子抑制神经元凋亡。尽管联合组对MDA及HO-1、NQO1的表达呈现非同步变化，研究人员认为这主要与脂肪酸代谢底物的瞬时增加以及Nrf2抗氧化反馈调节有关。

研究结论指出：该研究利用网络药理学预测了GBE与MLCT协同延缓AD进展的潜在作用，结果提示二者可能通过减轻氧化应激和降低神经元凋亡发挥效应。为此，研究构建了H₂O₂诱导的HT22细胞氧化应激体外模型进行验证。结果表明，无论是单独还是联合使用，GBE与MLCT均表现出神经保护作用。本研究结果为开发用于预防或治疗AD的功能性脂质、植物提取物、药品及保健食品提供了有价值的新思路；未来可结合动物实验、多组学、神经影像学和人工智能等手段，进一步明确GBE与MLCT改善认知的精准干预策略。