不同茶多酚与山羊肌球蛋白(myosin)相互作用及其多功能增强协同策略研究

《Journal of Future Foods》：Study on the interactions of different tea polyphenols with goat myosin and their synergistic strategy for multifunctional enhancement

　　

摘要：山羊肌球蛋白(myosin)是主导肉制品品质与功能特性的重要肌肉蛋白质，但其理化性质与结构稳定性限制了其大规模工业应用。多酚已被证实可优化蛋白质溶解度、抗氧化能力等功能性属性。因此，本研究假设表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)与表没食子儿茶素(epigallocatechin, EGC)可与肌球蛋白相互作用，从而调控其结构并改善理化性质。结果表明，两种多酚均与山羊肌球蛋白结合形成稳定复合物。肌球蛋白的二级与三级结构发生明显改变，伴随α?螺旋比例降低及随机卷曲(random coil)含量呈浓度依赖性升高，表明有序结构向无序构象展开。100 μmol/L时，EGCG与EGC组随机卷曲含量分别升高15.52%与6.70%。分子动力学(molecular dynamics, MD)模拟证实多酚掺入后复合物稳定性提高，疏水相互作用与氢键为主要结合力。80 μmol/L时，EGCG与EGC结合率分别达18.80%与19.03%。100 μmol/L时，二者DPPH自由基清除能力分别达80.68%与79.33%。综合理化表征与体外消化(in vitro digestion)实验表明，多酚?肌球蛋白相互作用提高了蛋白质溶解度与抗氧化活性，但降低了表面疏水性(surface hydrophobicity)与消化率(digestibility)。总体而言，EGCG比EGC表现出更强的修饰效应。本研究为通过茶多酚干预对山羊肌球蛋白进行功能性改性提供了理论支撑与产业实践参考。

论文解读：不同茶多酚与山羊肌球蛋白相互作用及其多功能增强协同策略研究

研究背景与意义

羊肉及山羊肉因富含优质蛋白、不饱和脂肪酸、B族维生素及微量元素且低脂肪低胆固醇而广受青睐。肌原纤维蛋白中，肌球蛋白(myosin)是决定肉品质地与功能特性的核心组分，山羊宰后肌球蛋白发生动态变化进而影响肉色与嫩度。然而天然肌球蛋白存在溶解性差、结构不稳定等局限，制约了其在加工中的广泛应用。已有研究表明多酚可通过共价或非共价作用与肉类蛋白结合并改变其结构与交联过程，茶多酚主要活性成分为儿茶素类如EGCG（epigallocatechin gallate，表没食子儿茶素没食子酸酯）与EGC（epigallocatechin，表没食子儿茶素），具抗氧化、抗菌特性并已用于肉制品保鲜，但既往多集中于乳或植物蛋白，对肉类特别是山羊肌球蛋白的系统性调控机制尚缺。因此Wan Xiaohui、Zhang Duoduo、Ding Jiwei等研究人员假设EGCG与EGC通过非共价作用与山羊肌球蛋白结合并调控其构象与理化功能，以探究其相互作用机制及改性效果。该研究发表于《Journal of Future Foods》，为利用天然植物源多酚改善山羊肉肌原纤维蛋白营养、加工及健康属性提供了分子层面的理论依据。

主要关键技术方法概述

研究人员以市售新鲜山羊肉为样本提取山羊肌球蛋白，分别与系列浓度（0、20、40、60、80、100 μmol/L）EGCG与EGC水溶液—乙醇（30:70, v/v）混合制备复合物。采用荧光光谱（激发280 nm，发射300–500 nm）结合Stern?Volmer方程分析荧光猝灭类型；傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FT?IR，4000–400 cm^?1）分析二级结构变化；圆二色光谱（circular dichroism, CD，200–260 nm）定量α?螺旋、β?折叠、β?转角及随机卷曲含量；AutoDock Vina进行分子对接预测结合位点；GROMACS进行100 ns分子动力学(molecular dynamics, MD)模拟分析RMSD、RMSF及氢键数；酒石酸比色法测多酚结合率；DPPH与ABTS法测抗氧化能力；Ellman试剂测巯基（sulfhydryl, SH）含量；1?苯胺基?8?萘磺酸（8?anilino?1?naphthalenesulfonic acid, ANS）荧光探针测表面疏水性；离心法测溶解度；INFOGEST标准改良法模拟口腔—胃—肠三相体外消化(in vitro digestion)，BCA法测蛋白消化率及多酚释放率。数据经SPSS单因素方差分析与Tukey检验（p < 0.05），各实验至少三次重复。

研究结果

3.1. Interactions between polyphenols and goat myosin（多酚与山羊肌球蛋白的相互作用）

3.1.1. Fluorescence spectroscopy analysis（荧光光谱分析）：肌球蛋白内源荧光最大发射峰位于324 nm，随EGCG与EGC浓度升高荧光强度递减且发生红移，表明多酚与肌球蛋白芳香族氨基酸残基结合并改变其微环境；EGCG猝灭能力强于EGC。Stern?Volmer方程计算得K_q（EGCG?肌球蛋白）= 7.2×10¹²L/(mol·s)，K_q（EGC?肌球蛋白）= 5.1×10¹¹L/(mol·s)，均大于动态碰撞猝灭上限2.0×10¹⁰L/(mol·s)，判定为静态猝灭（static quenching），即形成基态非荧光复合物。

3.1.2. Fourier transform infrared spectroscopy (FT?IR) analysis（傅里叶变换红外光谱分析）：酰胺Ⅰ带（1700–1600 cm^?1）强度减弱并红移，未出现新共价键特征峰，表明多酚引起肌球蛋白二级结构改变及内部疏水残基暴露，但无共价交联生成。

3.1.3. Circular dichroism analysis（圆二色光谱分析）：纯肌球蛋白含α?螺旋28.05%、β?折叠23.70%、β?转角21.57%、随机卷曲26.66%；加入多酚后α?螺旋下降、随机卷曲上升，100 μmol/L EGCG组α?螺旋降至18.45%、随机卷曲升至42.18%，EGC组分别降至21.25%与33.30%，表明蛋白有序结构向无序构象展开，EGCG诱导构象扰动更强。

3.2. Molecular docking（分子对接）

Myosin subunit 1?EGCG结合能?10.2 kcal/mol，myosin subunit S1?EGCG ?9.3 kcal/mol；myosin subunit 1?EGC ?9.4 kcal/mol，myosin subunit S1?EGC ?9.1 kcal/mol，显示两者均具强亲和力。对接分析表明EGCG与肌球蛋白多个残基（Leu1425、Arg702等）形成氢键及疏水作用，EGC亦与Lys125、Asn231等残基形成氢键与疏水作用，氢键与疏水相互作用共同维持复合物稳定，EGCG平均氢键数更多。

3.3. Molecular dynamics simulation（分子动力学模拟）

RMSD显示肌球蛋白?EGCG与肌球蛋白?EGC复合物于40–60 ns后趋于平衡且RMSD低于游离肌球蛋白，RMSF波动亦小于游离蛋白，表明多酚结合提升了体系构象稳定性。氢键分析显示肌球蛋白?EGCG复合物氢键数稳定在5–8条，肌球蛋白?EGC稳定在3–5条，进一步证实EGCG修饰效应更强，氢键与疏水作用是主要结合驱动力。

3.4. Physicochemical changes of the myosin?polyphenol complexes（肌球蛋白?多酚复合物理化性质变化）

3.4.1. Polyphenol binding rate（多酚结合率）：结合率随多酚浓度升高而增加，80 μmol/L时达峰值，EGCG组18.80 ± 1.24%，EGC组19.03 ± 11.54%；超过80 μmol/L因蛋白结合位点饱和而略降。

3.4.2. Antioxidant capacity（抗氧化能力）：纯肌球蛋白DPPH清除率45.82%，100 μmol/L EGCG与EGC组分别升至约82.79%与82.17%；ABTS清除率由19.21%分别升至74.64%（EGCG）与68.31%（EGC），呈浓度依赖性增强，EGCG总体抗氧化性强于EGC。

3.4.3. Sulfhydryl group content（巯基含量）：纯肌球蛋白游离巯基24.38 μmol/100 mg蛋白，100 μmol/L EGCG组降至8.82 μmol/100 mg，EGC组降至13.97 μmol/100 mg，说明多酚与肌球蛋白Cys残基巯基发生作用使其掩蔽，EGCG作用更显著。

3.4.4. Surface hydrophobicity and solubility（表面疏水性与溶解度）：纯肌球蛋白表面疏水性50,248，100 μmol/L EGCG与EGC组分别降低约3.64倍与3.05倍；溶解度由9.43%分别升至21.48%（EGCG）与23.49%（EGC），表明多酚引入极性酚羟基并掩盖疏水区使亲水性增加、溶解性改善。

3.5. In vitro digestion characteristics of the myosin?polyphenol complexes（肌球蛋白?多酚复合物体外消化特征）

3.5.1. Protein digestibility（蛋白质消化率）：胃肠消化初始阶段复合物消化率低于对照，因多酚?蛋白大复合物对酶解有一定抵抗；胃消化阶段MG（EGCG组）消化率低于MC（EGC组）；肠消化阶段随肽键断裂复合物解离，240 min时复合物组消化率趋近对照组。

3.5.2. Polyphenol release rate（多酚释放率）：胃相释放率低，肠相释放率显著升高，说明多酚主要在肠道从复合物中解离释放；EGCG?肌球蛋白结合更强故释放率低于EGC组。

讨论与结论总结

研究人员通过光谱学、分子对接、100 ns分子动力学模拟及体外消化模型证实，EGCG与EGC可通过静态猝灭方式非共价结合山羊肌球蛋白，主要作用力为氢键与疏水相互作用，结合使肌球蛋白α?螺旋减少、随机卷曲增加，有序结构展开并暴露反应位点。80 μmol/L时结合率近20%，100 μmol/L时显著提升DPPH与ABTS自由基清除能力并改善溶解度、降低表面疏水性，但初期消化率有所下降且多酚主要于肠段释放。EGCG因多一个没食子酰基及更多酚羟基，整体构象修饰与抗氧化增效作用强于EGC。结论如下（译自原文Conclusion）：

本研究探讨了EGCG与EGC和山羊肌球蛋白的相互作用及其对蛋白结构、功能性质和体外消化的调控效应。结果表明两种茶多酚均通过静态荧光猝灭与肌球蛋白形成稳定非共价复合物，改变了芳香族氨基酸残基微环境并诱导三级结构变化。二级结构由有序向无序转化，表现为α?螺旋降低及随机卷曲升高（100 μmol/L时EGCG与EGC组分别升高15.52%与6.70%）。分子模拟验证疏水相互作用与氢键为主要结合力，复合物比纯肌球蛋白具更高结构稳定性。80 μmol/L时最大结合率分别为18.80%与19.03%。100 μmol/L时抗氧化活性显著增强、表面疏水性降低、溶解度明显提高。体外胃肠消化显示蛋白消化延迟且多酚主要在肠阶段释放。总体而言，本研究为茶多酚与山羊肌球蛋白分子间相互作用提供了新认识，可为利用天然植物源化合物改善山羊肌原纤维蛋白营养、加工及促健康属性提供理论基础；未来可关注新型加工技术对上述复合物的影响及多糖等协同组分的多功能调控策略。