空间代谢组学揭示黑果枸杞（Lycium ruthenicum）果实成熟过程中糖类与花青素时空动态

《Journal of Future Foods》：Spatial metabolomics reveals the spatiotemporal dynamics of sugars and anthocyanins during Lycium ruthenicum fruit ripening

　　

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.)是一种具有显著抗氧化活性的重要植物资源，其主要抗氧化成分为碳水化合物和花青素。为探究果实发育过程中这些代谢物的动态变化，研究人员将浆果分为三个发育阶段：幼果期(LR1)、转色期(LR2)和成熟期(LR3)。研究结果表明，生物活性物质的积累和功能显著增强，其中LR3期果实的总多糖、总花青素含量和抗氧化活性分别达LR1期的1.61倍、3.5倍和1.75倍。代谢物在果实组织中的空间分布对于提升采后品质至关重要，然而该方面在黑果枸杞中尚未见报道。本研究采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱成像(MALDI-MSI)技术分析了果实三个发育阶段的代谢谱，共注释到638个代谢物相关特征，其中6.6%为碳水化合物，9.2%为聚酮类，19.7%为莽草酸及苯丙素类（包括四种推定注释的花青素组分）。质谱成像与非靶向代谢组学联用揭示，单糖主要富集于果肉和果皮，直接影响果实风味；随着含量增加，花青素（如天竺葵素-3-葡萄糖苷）的分布由表皮富集转变为均匀分布，在LR3期达到峰值，该模式与采后色泽均匀性密切相关。值得注意的是，特定糖类与花青素的重叠空间分布暗示二者在抗氧化防御中存在潜在关联。在此基础上，研究人员提出糖供应促进花青素糖基化与积累的假设。这些发现深化了对黑果枸杞代谢物分布规律的认识，为果实品质的空间调控提供了新方向。

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）是一种重要的"药食同源"植物资源，属于茄科野生多年生棘状灌木，主要分布于中国西北沙漠地区，在传统中式营养补品中应用已有数千年历史。其浆果富含黄酮类、花青素、酚酸、多糖、类胡萝卜素、生物碱、矿物质、维生素、精油和脂肪酸等多种生物活性成分。果实成熟过程中的代谢物变化直接影响果皮色泽、风味和香气等品质特征。可溶性糖是形成黑果枸杞独特风味的物质基础，而花青素积累水平则决定其营养价值和市场竞争力。尽管关于黑果枸杞多糖和花青素的研究已较为广泛，但糖和花青素的空间分布研究仍然匮乏。此外，鲜枸杞易受真菌侵染而腐烂，现有研究主要依赖组织匀浆进行整体成分分析，虽能获得代谢物总量信息，但无法揭示这些代谢物在不同果实组织区域的原位分布特征。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)虽能实现化学成分的快速、灵敏定性定量分析，但其无法动态解析代谢物的空间分布。空间代谢组学（spatial metabolomics）可从亚微米到宏观尺度进行代谢物图谱绘制，实现蛋白质、聚糖、小分子代谢物和脂质等空间分辨化学图谱的可视化与定量，为理解果实品质形成的空间调控机制提供了新视角。

本研究发表于《Journal of Future Foods》，旨在阐明黑果枸杞果实不同发育阶段碳水化合物和花青素代谢物的动态变化及其抗氧化活性，并利用空间代谢组学可视化这些代谢物的时空分布模式，探索其潜在代谢互作关系。

本研究用到的主要关键技术方法包括：采集新疆和田地区皮山县的黑果枸杞果实，设置7天(LR1)、21天(LR2)和35天(LR3)三个发育阶段样本队列（3株生物学重复）；采用苯酚-硫酸法测定总多糖含量，pH示差法测定总花青素含量；通过FRAP、DPPH和ABTS三种方法评估抗氧化活性；利用高效液相色谱(HPLC)进行花青素组分分析；运用基质辅助激光解吸电离质谱成像(MALDI-MSI)技术，以N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐(NEDC)为基质，在负离子模式下进行空间分辨率为30μm的质谱成像分析；结合超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱(UHPLC-Orbitrap HRMS)进行非靶向代谢组学分析，采用正负离子交替模式，通过主成分分析(PLS-DA)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库注释差异积累代谢物(DAMs)。

研究结果显示：总多糖和总花青素含量随果实发育显著增加，LR3期总多糖含量达14.30%，LR1期仅为4.06%；总花青素含量从8.41 mg/g升至12.83 mg/g。抗氧化能力分析表明，总抗氧化能力、DPPH和ABTS自由基清除率均随果实发育显著提升，总花青素含量与DPPH（r=0.98，P<0.05）和ABTS（r=0.96，P<0.05）呈显著正相关。

差异代谢物分析揭示，76.57%的差异代谢物富集于代谢通路，其中5.94%和5.24%分别与苯丙氨酸生物合成和类黄酮生物合成通路相关。49种花青素衍生物和53种碳水化合物化合物呈现显著的阶段特异性分布模式：花青素积累动态在LR1-LR3期间变化显著，矢车菊素含量在LR3期增加1.14倍，酰基化花青素呈现LR3期特异性积累；碳水化合物组成呈动态变化，单糖（葡萄糖、甘露糖）和磷酸化糖主导LR1期，二糖（麦芽糖、纤维二糖）在LR2期达峰，而棉子糖家族寡糖和糖醛酸衍生物在LR3期丰度最高。

质谱成像共注释638个代谢物相关特征，其中6.6%为碳水化合物，19.7%为莽草酸和苯丙素类。糖类的空间分布表现为：D-吡喃葡萄糖、潘糖（panose）和α-麦芽糖在LR2期主要积累于种子组织，至LR3期均匀分布于整个果实；3,6-脱水-D-半乳糖、6-脱氧-L-吡喃甘露糖和D-阿拉伯糖酸主要定位于中果皮和内果皮，在外果皮或种子中检测极少。单糖呈现双峰积累模式，在坐果初期和成熟阶段达到峰值；α-麦芽糖随成熟逐渐降低，与淀粉酶促降解为可溶性糖的过程一致；潘糖在LR1-LR2过渡期特异性积累于种子组织，表明其在早期储备动员中的功能。

花青素的空间分布研究显示，四种推定注释的花青素衍生物（天竺葵素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-芸香糖苷、天竺葵素-3-芸香糖苷-5-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷-5-O-葡萄糖苷）优先富集于表皮组织，种子中几乎检测不到。发育初期花青素严格定位于外果皮，随后逐渐向心扩散，至成熟期在整个果皮中建立近均匀分布。定量分析显示，天竺葵素-3-葡萄糖苷呈单调积累，在LR3期达最大值；天竺葵素-3-芸香糖苷呈双相动力学特征，LR1至LR2过渡期短暂下降后持续上升；天竺葵素-3-芸香糖苷-5-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷-5-O-葡萄糖苷在LR2期达最高水平。

HPLC分析确认LR2和LR3期果实中存在飞燕草素、矢车菊素和天竺葵素，而矮牵牛素始终低于检测限。成熟果实中含飞燕草素5.48 mg/g、矢车菊素10.47 mg/g和天竺葵素17.71 mg/g。矢车菊素型与天竺葵素型花青素为黑果枸杞中的主导色素，矢车菊素积累呈现明显的发育调控模式，与果实从绿红到深紫的色泽转变相关，可作为生化成熟度标志物。

讨论部分指出：花青素在果实发育早期位于外果皮，有助于抵御紫外线和病原体侵害；随着果实成熟，花青素扩散至内果皮，这种均匀分布与采后果实色泽一致性相关，可能通过转运蛋白上调、液泡pH降低和细胞壁修饰实现。不同类型花青素的分布模式存在差异，推定矢车菊素糖苷仅在早期表皮分布，而推定天竺葵素糖苷在各阶段广泛分布于整个果皮，这可能与不同花青素苷元的稳定性差异有关。单糖作为可溶性甜味剂和花青素糖基化的关键前体，直接影响果实风味并调节花青素的生物合成效率和稳定性；寡糖在种子中的组织特异性富集可为种子发育提供碳源、增强抗逆性、减少采后腐烂。研究人员分析了糖相关代谢物与花青素生物合成的关系，发现尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose)与天竺葵素衍生物呈现相似模式，其前体与UDP-葡萄糖聚类，提示二者在花青素糖基化通路中存在潜在关联。6-脱氧-L-吡喃甘露糖和6-O-(6-脱氧-α-L-吡喃甘露糖基)-D-吡喃半乳糖苷直接影响复杂花青素糖苷的生物合成 efficiency。

研究结论部分翻译如下：本研究利用MALDI-MSI结合LC-MS/MS技术，揭示了黑果枸杞成熟过程中关键代谢物的空间模式，克服了传统匀浆分析的局限性。推定花青素由外果皮富集重分配至整个果皮的均匀分布，决定了采后果实的色泽均匀性与稳定性。单糖、二糖和寡糖在果肉和种子中呈组织特异性积累，与风味形成和能量供应密切相关。潘糖在种子中的富集为种子抗逆性和采后果实品质维持提供了关键代谢靶点。基于代谢物的重叠分布和同步积累，研究人员假设糖供应促进花青素的糖基化与积累。尽管糖-花青素互作机制尚需多组学验证，但这些发现深化了对黑果枸杞代谢物分布规律的认识，为果实品质的空间调控提供了新方向。LR3成熟期被确定为最佳采收时期，此时花青素含量达峰且在果肉中均匀分布，可据此制定靶向保鲜策略（如调控贮藏pH）以维持花青素稳定性、延缓采后褐变和色素降解。