锌改性甲壳素纳米纤维（Zn@ChNFs）的制备及其通过抗菌活性与氧化酶调控对病原菌污染型微绿苗生长的影响

《Journal of Future Foods》：Preparation of Zn@ChNFs and Their Effects on Pathogen-Contaminated Microgreen Growth via Antimicrobial Activity and Oxidative Enzyme Modulation

　　

微绿苗生产极易受到食源性病原菌种子携带性污染的威胁，从而危及食品安全与植株性能。在本研究中，研究人员制备并表征了锌改性甲壳素纳米纤维（Zn@ChNFs）作为一种多功能纳米材料，旨在同时控制微生物污染并促进微绿苗生长。Zn@ChNFs通过过硫酸铵（APS）氧化后接枝Zn配位的方式合成，在保持甲壳素纳米纤维（ChNFs）原有纳米纤维结构的同时实现了最高2.9%的Zn负载量。Zn@ChNFs对单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）表现出显著增强的抗菌活性，使受污染萝卜种子上的菌落数降低超过1.04 log CFU/g，并在微绿苗生长期间维持对病原菌的持续抑制。与水处理和纯ChNFs处理相比，Zn@ChNFs在细菌胁迫下显著提高了种子萌发率、茎长、叶面积及生物量积累。此外，Zn@ChNFs促进了氮素同化和叶绿素生物合成，从而改善了光合性能。营养与生化分析显示蛋白质、多酚和黄酮含量增加，同时DPPH和ABTS抗氧化能力增强。关键抗氧化酶——过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性也显著升高，表明其对病原菌诱导的氧化应激具有有效缓解作用。综上所述，这些结果证实Zn@ChNFs提供了一种集抗菌与营养改善于一体的综合策略，为提升微绿苗生产中的微生物安全性与营养品质提供了一种可持续的纳米材料平台。

微绿苗（microgreens）因其富含维生素、多酚、抗氧化剂及其他具有健康促进和慢性病预防作用的生物活性植物化学物质而备受关注。然而，微绿苗易受沙门氏菌（Salmonella enterica）和单核细胞增生李斯特菌等食源性病原菌污染，近年来已引发多起产品召回事件。种子携带是病原菌进入微绿苗生产系统并增殖的主要途径，常规化学消毒剂虽能减少种子表面微生物负荷，但其效果不稳定且存在潜在健康与环境风险，应用接受度日益受限。因此，开发生物相容、可生物降解且可持续的抗菌替代方案对于微绿苗生产至关重要。金属改性生物聚合物纳米材料成为有前景的候选方案，其中锌（Zn）因其公认的抗菌特性以及在植物生长和人体营养中的重要作用而备受关注。Zn是植物体内多种生理生化过程所必需的微量元素，参与叶绿素生物合成、碳水化合物代谢、激素合成与调控、DNA完整性维持、光合作用、酶激活及膜稳定性等过程，同时在活性氧（ROS）管理中发挥关键作用，可作为抗氧化酶的辅因子并稳定蛋白质结构。已有研究表明，Zn生物强化可显著改善微绿苗的营养品质和生长性能。基于上述背景，研究人员开展了Zn@ChNFs的制备与功能研究。

本研究采用的技术路线主要包括：通过深共晶溶剂（DES）从龙虾壳中提取甲壳素，经APS氧化制备ChNFs，再通过Zn²⁺与纳米纤维表面羧基配位合成Zn@ChNFs；采用Zeta电位分析确定最优Zn负载量；运用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）、原子力显微镜（AFM）、扫描电子显微镜（SEM）、能量色散X射线光谱（EDS）及电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）进行材料结构表征与元素定量；通过微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）；以单核细胞增生李斯特菌污染的萝卜种子为模型，评估种子去污效果及微绿苗生长期间（第3天和第7天）的微生物动态；测定萌发率、茎长、叶面积、鲜重和干重等生长参数；采用杜马斯燃烧法测定氮碳含量，Arnon法测定叶绿素含量；通过BCA法、Folin-Ciocalteu法和氯化铝法分别测定总可溶性蛋白、总多酚和总黄酮含量；DPPH和ABTS法评价抗氧化能力；最后测定CAT和POD活性以阐明Zn@ChNFs在细菌胁迫下促进微绿苗生长的作用机制。

**Zn@ChNFs的制备与表征**

研究人员以DES提取的龙虾壳甲壳素为原料，经APS氧化制备ChNFs（产率约63.92%），再通过Zn²⁺与纳米纤维表面去质子化-COO^-基团配位合成Zn@ChNFs。Zeta电位分析显示，随着Zn负载量增加，纳米纤维表面电位从-33.74±1.97 mV逐渐升高至接近中性，Zn200@ChNFs与Zn300@ChNFs间差异极小，表明200 mg醋酸锌为最优负载量，此时Zn质量分数达2.9%。FTIR分析证实Zn200@ChNFs中1734 cm^-1处游离羧基峰消失，且3300 cm^-1附近-OH和-NH伸缩振动区域减弱，表明Zn²⁺与-COO^-成功配位并部分取代了氢键网络。XRD结果显示Zn200@ChNFs结晶度（80.3%）低于ChNFs（88%）但高于DES-甲壳素（77.87%），说明Zn配位在纤维表面形成配位复合物，部分破坏了链间氢键而非进一步去除无定形区。AFM和SEM形貌观察表明，Zn配位未破坏或改变ChNFs固有的针状纳米纤维形态，长度和宽度分别维持在约200 nm和9 nm。EDS检测到Zn特征峰，ICP-OES定量分析证实最大Zn负载量为2.9%。

**抗菌活性**

研究人员评估了ChNFs和Zn200@ChNFs对单核细胞增生李斯特菌和肠道沙门氏菌的MIC和MBC。纯ChNFs对两种病原菌的MIC值较高，抗菌活性有限；而Zn200@ChNFs的MIC值显著降低，表明Zn配位大幅增强了细菌生长抑制作用。然而，Zn200@ChNFs的MBC未能检出，说明2.9%的Zn负载量尚不足以实现完全杀菌，这与此前研究报道的Zn盐需要较高浓度才能达到杀菌效果一致。基于MIC结果，研究人员选择50 μg/mL和100 μg/mL作为种子去污和微绿苗培育的应用浓度。

**种子去污**

Zn@ChNFs处理对萝卜种子上的单核细胞增生李斯特菌实现了最大幅度的削减。与初始接种量和水处理相比，Zn@ChNFs处理使李斯特菌数显著（P<0.05）降低超过1.56和1.04 log CFU/g，其中Zn200@ChNFs100去污效率最高。该结果清晰表明Zn²⁺的引入显著增强了ChNFs的抗菌性能，这种增效可能源于Zn破坏细菌膜完整性、干扰关键代谢酶与ChNFs高比表面积增强Zn-细菌相互作用的协同效应。

**微绿苗微生物分析**

受污染萝卜种子萌发后第3天和第7天的微生物监测显示，初始李斯特菌接种量为7.95±0.02 log CFU/g，各处理组菌量随时间下降，Zn@ChNFs组降幅最大。第3天时，Zn200@ChNFs100组降至5.88±0.04 log CFU/g，较水处理组降低超过1 log CFU/g，较初始接种量降低超过2 log CFU/g。第7天时各处理组菌量保持稳定，未出现细菌再生，这可能是由于水培微绿苗系统营养受限，限制了细菌增殖。

**生理特性影响**

Zn@ChNFs有效去污不仅降低了李斯特菌污染，还提高了萝卜种子的萌发率。Zn200@ChNFs100处理将萌发率显著提升至96±1.9%，而水处理仅为88.3±1.6%（P<0.05）。值得注意的是，水和ChNFs处理组的萌发率均低于无病原菌污染的水处理对照组（H₂O NL），表明李斯特菌可能与种子竞争营养从而阻碍萌发；而Zn@ChNFs处理组的萌发率与对照组相当或略高，说明Zn@ChNFs不仅抑制了细菌生长，还提供了Zn和氮等微量与大量营养元素，可能作为早期种子代谢和能量激活相关酶的辅因子发挥作用。

生长参数测定显示，Zn@ChNFs显著改善了萝卜微绿苗生长。Zn200@ChNFs100在茎长（6.76±0.15 cm）、叶面积（1.53±0.08 cm²）以及鲜重（9.03±0.19 g）和干重（0.78±0.01 g）方面均达最高值，显著优于水处理和病原菌污染下的ChNFs处理（P<0.05）。这种改善归因于Zn提供的抗菌保护减少了细菌对萌发期营养的竞争，同时Zn作为微量元素促进了茎伸长和生物量积累。

**氮与叶绿素含量**

氮含量分析表明，Zn200@ChNFs100（6.87±0.43%）和ChNFs100（6.71±0.20%）显著高于其他处理组（P<0.05），说明ChNFs可作为氮源，而Zn配位进一步提高了氮同化效率。各组碳含量无显著差异，表明Zn@ChNFs主要影响氮代谢而非改变总体碳积累。叶绿素含量受Zn掺入的显著影响，Zn200@ChNFs100的叶绿素a（44.46±0.06 mg/100g）、叶绿素b（14.71±1.74 mg/100g）及总叶绿素（58.99±1.68 mg/100g）均达最高，分别是水处理组的约2.1倍和H₂O NL组的约1.7倍。这种增强归因于Zn作为δ-氨基乙酰丙酸脱水酶和碳酸酐酶等叶绿素生物合成关键酶辅因子的必需作用，充足的Zn供应维持了叶绿体完整性，增强了CO₂固定，防止了氧化性叶绿素降解。

**营养分析**

营养含量分析显示，Zn200@ChNFs100和ChNFs100的蛋白质含量最高，分别达340.56±3.89和330.11±2.72 mg牛血清白蛋白当量/克干重（mg BSAE/g DW）（P<0.05），表明ChNFs补充尤其是结合Zn后可改善萝卜微绿苗的蛋白质生物合成，这可能归因于氮可利用性和同化效率的提高，以及Zn作为RNA聚合酶等蛋白质合成相关酶辅因子的作用。次级代谢产物方面，Zn200@ChNFs100在细菌胁迫下总多酚和总黄酮含量分别达32.35±3.07 mg没食子酸当量/克干重（mg GAE/g DW）和69.87±5.56 mg芦丁当量/克干重（mg RE/g DW），为最高水平。这种增强可能是氮富集和Zn配位共同作用的结果：氮可得性刺激酚类化合物和黄酮类生物合成，而Zn²⁺增强苯丙烷途径中苯丙氨酸解氨酶和酪氨酸解氨酶等关键酶活性。与此一致，DPPH和ABTS自由基清除活性在Zn200@ChNFs100中显著最高，分别达8.35±0.11和12.60±0.70 mmol Trolox当量/克干重（mmol TE/g DW），表明Zn@ChNFs不仅改善了营养组成，还强化了细菌胁迫下的抗氧化防御机制。

**抗氧化酶变化**

POD和CAT活性测定显示，Zn@ChNFs处理显著提高了两种抗氧化酶活性。Zn200@ChNFs100的POD活性最高（1638.89±36.14 U/g*min 鲜重），是H₂O NL（647.78±45.57 U/g*min 鲜重）和水处理（593.33±3.14 U/g*min 鲜重）的2.5倍以上（P<0.05）。CAT活性呈现相似趋势，Zn200@ChNFs100达53.33±1.57 U/g*min 鲜重，显著高于水处理（26.58±2.14 U/g*min 鲜重）和H₂O NL（42.22±3.14 U/g*min 鲜重）（P<0.05）。POD和CAT的大幅提升表明Zn的引入不仅缓解了李斯特菌诱导的氧化应激，还增强了萝卜微绿苗的整体抗氧化防御系统。Zn作为多种抗氧化酶的辅因子，通过结合半胱氨酸和组氨酸等氨基酸残基稳定酶蛋白结构，促进抗氧化途径激活。ChNFs的高比表面积和功能基团有助于Zn²⁺的吸附和滞留，从而促进其与植物组织的相互作用，改善酶活性和氧化还原稳态。

综上所述，本研究成功制备并表征了源自DES-甲壳素的Zn@ChNFs。FTIR、XRD、AFM、SEM、EDS和ICP-OES等结构分析证实Zn²⁺离子成功配位于ChNFs表面羧基，且未破坏其纳米纤维形态。此外，Zn@ChNFs对单核细胞增生李斯特菌表现出强抗菌活性，种子上实现超过1 log CFU/g的削减并在微绿苗生长期间维持抑制效果。同时，Zn@ChNFs显著提高了萌发率、生物量积累、叶绿素合成和氮同化。在生化层面，其上调了CAT和POD等抗氧化酶活性，增加了酚类和黄酮含量，从而提升了整体抗氧化能力。总体而言，Zn@ChNFs展示了结构稳定性、抗菌功效和生物功能增强的整合特性，为改善微绿苗生产中的微生物安全性和营养品质提供了一种可持续的纳米材料平台。