Pemt抑制介导的Vdac1寡聚化调控高脂饮食（HFD）诱导肝损伤中的线粒体功能障碍、细胞凋亡和炎症

《Advanced Science》：Pemt Inhibition-Mediated Vdac1 Oligomerization Regulates Mitochondrial Dysfunction, Apoptosis, and Inflammation in High-Fat Diet-Derived Liver Injury

　　

高脂饮食（HFD）诱导的肝损伤是一种在脊椎动物中广泛存在的病理状态，但其分子机制尚未完全阐明。本研究鉴定出磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶（phosphatidylethanolamine methyltransferase，Pemt/PEMT）——一种参与磷脂酰胆碱合成的关键酶——是HFD诱导肝损伤过程中线粒体稳态的重要调控因子。研究人员发现，在大黄鱼（Larimichthys crocea）肝细胞及斑马鱼（Danio rerio）肝脏中敲低或敲除pemt可显著诱导细胞凋亡、NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，Nlrp3/NLRP3）炎症小体激活及线粒体功能障碍。相反，在大黄鱼肝细胞中过表达PEMT能够有效减轻棕榈酸（palmitic acid，PA）诱导的细胞凋亡、Nlrp3炎症小体激活及线粒体功能障碍。重要的是，本研究揭示了Pemt与电压依赖性阴离子通道1（voltage-dependent anion channel 1，Vdac1/VDAC1）之间存在直接蛋白质–蛋白质相互作用。值得注意的是，VDAC1过表达可显著诱导活性氧（reactive oxygen species，ROS）依赖性细胞凋亡和Nlrp3炎症小体激活。机制上，pemt缺失增强Vdac1寡聚化，进而触发肝细胞凋亡和Nlrp3炎症小体激活。综上，研究结果表明，HFD诱导的Pemt下调可促进线粒体功能障碍和Vdac1寡聚化，从而加剧ROS依赖性细胞凋亡和Nlrp3炎症小体激活，最终导致肝损伤。上述发现确立了Pemt-Vdac1调控轴是脊椎动物抵御营养过剩诱导肝损伤的关键保护机制。

研究背景与科学问题

高脂饮食（HFD）诱导的肝损伤是跨越脊椎动物的保守病理过程，可由脂质蓄积进展为炎症性组织损伤；在人类中，代谢相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH）与HFD和代谢紊乱密切相关，已成为全球肝相关死亡的主要原因。模式鱼类在高脂饲喂下同样出现肝脂肪变性、血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）与天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性升高及炎症标志物上调。虽然靶向氧化应激、细胞凋亡与NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，Nlrp3/NLRP3）炎症小体激活可改善病情，但HFD驱动肝细胞毒性的核心机制仍不明确。磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）是线粒体主要结构磷脂，其合成依赖定位于内质网与线粒体相关膜（mitochondria-associated membranes，MAM）的Pemt/PEMT催化；MASH患者及HFD饲喂Pemt敲除小鼠均出现肝PEMT表达降低与严重肝损伤。另一方面，慢性脂质超载导致电子传递链（electron transport chain，ETC）过载并产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS可激活Nlrp3炎症小体并经线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）促进细胞色素C释放，激活Caspase9/Caspase3级联及多聚ADP核糖聚合酶1（poly ADP-ribose polymerase 1，PARP1）切割，最终导致肝细胞凋亡。电压依赖性阴离子通道1（Vdac1/VDAC1）作为线粒体外膜“守门员”蛋白，参与代谢、凋亡与炎症调控，但是否与PEMT协同调控线粒体功能尚不清楚。

研究设计与主要结论

研究人员以大黄鱼（Larimichthys crocea）和经CRISPR/Cas9获得的pemt^?/?斑马鱼（Danio rerio）作为脊椎动物模型，结合原代肝细胞敲低/过表达、PA刺激及Vdac1寡聚化抑制剂VBIT-12干预，系统解析Pemt在高脂诱导肝损伤中的作用。研究显示，HFD或PA可降低肝脏Pemt表达与PC水平，诱发线粒体功能障碍、ROS依赖性细胞凋亡和Nlrp3炎症小体激活；而PEMT过表达或抑制Vdac1寡聚化均能显著改善上述病理改变。结论表明，HFD诱导的Pemt下调通过促进Vdac1寡聚化加剧线粒体功能障碍，进而放大肝细胞凋亡与炎症反应；Pemt-Vdac1寡聚化轴构成脊椎动物抵御营养过剩性肝损伤的重要保护机制。该论文发表于《Advanced Science》，为代谢性肝病干预提供了新的保守性靶点。

主要技术方法

以大黄鱼与CRISPR/Cas9构建的pemt^?/?斑马鱼为模型，分别设置对照（12%脂肪）与高脂（18%脂肪）饲料饲喂10周和6周；原代大黄鱼肝细胞经siRNA/质粒转染后予以PA、NAC或VBIT-12处理。采用HE/TEM切片、生化试剂盒检测肝酶及氧化指标，TLC/ELISA/脂质组学分析脂质组成，流式细胞术测ROS与凋亡，JC-1检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP），RT-qPCR与Western blot检测基因蛋白表达，GST-pulldown/质谱、co-IP、BiFC及蛋白对接验证Pemt-Vdac1互作，EGS交联检测Vdac1寡聚化。

研究结果

HFD诱导大黄鱼肝损伤并抑制肝脏Pemt表达：饲喂高脂饲料10周后，大黄鱼体重、肝体指数及肝脏甘油三酯升高，血清ALT和AST活性显著上升，HE染色显示肝细胞脂肪变性；凋亡标志物及Nlrp3炎症小体相关蛋白显著上调，Caspase1活性及血清Il1β升高；透射电镜显示线粒体碎裂、嵴结构破坏，抗氧化指标下降而丙二醛升高；肝脏PC、PE含量及PC/PE比值降低，Pemt mRNA和蛋白表达下调。

Pemt介导PA诱导的大黄鱼肝细胞凋亡与炎症：敲低pemt上调凋亡相关蛋白（Cleaved-PARP1、Cleaved-Caspase3/9、Bax）并降低Bcl2，流式细胞术显示凋亡率升高，Nlrp3炎症小体激活；PEMT过表达可逆转PA诱导的上述变化。

pemt缺失诱导斑马鱼肝脏凋亡与炎症反应：CRISPR/Cas9构建的pemt^?/?斑马鱼肝体指数及血清ALT、AST升高，HE染色见肝细胞空泡化，TUNEL显示凋亡增加；肝脏凋亡与炎症蛋白标志物升高，Bcl2降低，促炎细胞因子表达上调。

Pemt维持鱼类线粒体功能稳态：敲低pemt使大黄鱼肝细胞线粒体膜电位下降、ROS生成增加，线粒体融合与生物发生相关基因表达下调；PEMT过表达逆转PA诱导的线粒体功能障碍。pemt^?/?斑马鱼ROS水平升高、线粒体肿胀且嵴结构受损，肝脏心磷脂特别是含四条C18:2酰基链的心磷脂显著减少。

大黄鱼中Vdac1作为Pemt互作蛋白被鉴定：Pemt同时定位于线粒体和内质网，提示其存在于MAM；GST-pulldown、共聚焦共定位、蛋白对接、co-IP及双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）实验均证实Pemt与Vdac1直接互作。

Vdac1-ROS通路介导PA诱导的大黄鱼肝细胞凋亡与炎症：VDAC1过表达上调凋亡与Nlrp3炎症小体标志物并增加凋亡率，vdac1敲低则减轻PA诱导的凋亡与炎症；ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可阻断VDAC1过表达所致ROS升高及其下游凋亡与炎症反应，提示VDAC1通过ROS介导损伤。

Pemt抑制介导的Vdac1寡聚化调控鱼类凋亡与炎症：pemt敲低增加Vdac1蛋白表达及其寡聚化水平，PEMT过表达逆转PA诱导的Vdac1寡聚化；VBIT-12处理pemt敲低肝细胞可显著降低凋亡与炎症标志物；在pemt^?/?斑马鱼中腹腔注射VBIT-12可降低血清ALT、AST活性，减轻肝脏凋亡与Nlrp3炎症小体激活，表明pemt缺失通过Vdac1寡聚化介导肝损伤。

讨论与结论

正文讨论指出，HFD诱导的线粒体损伤是触发细胞凋亡与Nlrp3炎症小体激活并导致肝损伤的保守环节。PEMT作为MAM上的关键PC合成酶，对维持线粒体结构与功能稳态至关重要；HFD通过抑制Pemt表达降低PC水平，破坏线粒体膜完整性，减少心磷脂含量，抑制线粒体融合与生物发生，导致ROS过度生成。研究人员进一步鉴定Vdac1为Pemt的线粒体外膜互作蛋白，发现Pemt缺失可解除对Vdac1寡聚化的抑制，使Vdac1由单体转向寡聚体并形成大孔通道，促进ROS释放及促凋亡蛋白转运，从而放大ROS依赖性细胞凋亡与Nlrp3炎症小体激活。使用VBIT-12阻断Vdac1寡聚化可有效缓解pemt敲低细胞和pemt^?/?斑马鱼的肝损伤、凋亡与炎症，进一步验证Pemt-Vdac1寡聚化轴在营养过剩性肝损伤中的核心作用。

研究结论：HFD诱导的肝脏Pemt表达降低通过促进Vdac1寡聚化加剧线粒体功能障碍，从而放大细胞凋亡与炎症反应；Pemt-Vdac1寡聚化轴可作为缓解脊椎动物线粒体功能障碍相关肝损伤的潜在靶点。