一种具有机械自适应和活性氧驱动纳米呼吸功能的病理指导性诊疗一体化平台用于精准心肌修复

《Advanced Science》：A Pathology-Instructed Theranostic Platform with Mechanoadaptive and ROS-Powered Nanobreathing Functions for Precision Myocardial Repair

　　

当前心肌梗死（myocardial infarction, MI）生物材料往往无法动态适应不断演变的病理微环境（如活性氧（reactive oxygen species, ROS）爆发、缺氧），缺乏机械相容性和原位反馈能力。为克服这些局限，研究人员开发了一种具有闭环病理响应系统的白蛋白水凝胶平台（BST）。BST是一种pH响应性水凝胶，功能化修饰了磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）/计算机断层扫描（computed tomography, CT）探针，并负载了线粒体靶向的过氧化氢酶-超氧化物歧化酶（catalase-superoxide dismutase, CAT-SOD）酶纳米凝胶（CSDT）。该水凝胶形成具有高剪切黏度（~300 Pa·s）、弹性和类心脏力学特性（~7.5 kPa）的自修复支架，以稳定梗死室壁。缺氧诱导的酸中毒触发CSDT纳米凝胶和白蛋白的释放，实现线粒体ROS清除和O₂生成，同时白蛋白恢复组织渗透平衡。这些作用共同减轻氧化应激、调节免疫反应，并通过增强自噬和抗凋亡通路促进心肌细胞存活。这种由内而外的反馈机制逆转氧化应激和缺氧，促使巨噬细胞向修复性M2表型转化，并使血管生成增加约2.5倍。在MI小鼠模型中，具有可编程生物降解性（~3周）的BST将左心室射血分数恢复至假手术组的~70%，并将28天存活率提高约2.5倍。此外，BST实现了材料保留和组织修复的实时MRI/CT追踪，允许梗死微环境的时空控制，推动精准MI治疗向临床转化迈进。

### 研究背景与现状问题

心血管疾病（cardiovascular diseases）仍是全球首要死因，其中急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是其最严重的后果。AMI由冠状动脉急性闭塞引发，导致线粒体功能障碍、过量活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生、厌氧糖酵解及乳酸酸中毒等一系列缺血性损伤，最终造成大范围心肌细胞死亡。随后，以单核细胞募集和M1巨噬细胞极化为特征的强烈炎症反应进一步加重组织损伤。尽管成纤维细胞驱动的瘢痕形成暂时恢复结构完整性，但会损害收缩功能，导致慢性心室僵化和心力衰竭。鉴于AMI病理的多面性，早期针对梗死微环境的干预至关重要。然而，当前临床干预手段如再灌注治疗和药物制剂主要聚焦于血运重建和梗死面积限制，在促进功能性再生方面存在不足，且伴随出血等严重并发症风险。因此，亟需开发既能保护缺血心肌，又能主动促进多阶段组织修复和功能再生的治疗策略。

水凝胶作为与天然软组织物理机械性质相似的三维富水网络，已 emerging 为心肌修复的有前景平台。近期ROS调节生物材料，包括ROS响应性水凝胶、免疫调节水凝胶和纳米酶抗氧化系统，为重塑病理性炎症或氧化微环境提供了 valuable 策略。但将机械适应性、持续ROS/缺氧调节、免疫调节和实时治疗监测整合于单一可注射水凝胶平台，同时保持机械相容性、生物响应性、简便给药的便易性和转化可行性，仍具挑战。

蛋白质基水凝胶，特别是源于天然生物大分子的水凝胶，在生物相容性、可生物降解性和生物学功能方面具有独特优势。血清白蛋白作为血浆主要蛋白，因其长体内半衰期、维持组织渗透平衡的作用及优良的药物结合能力，成为多功能水凝胶设计的理想构建单元。与其他常用蛋白质材料相比，血清白蛋白在临床使用、规模化工业生产及化学修饰便利性方面优势显著；其内在抗氧化特性和免疫调节功能有助于炎症消退和受损组织修复。机制上，血清白蛋白的氧化还原活性Cys34残基是细胞外游离巯基的主要储存库，与甲硫氨酸残基共同直接清除活性氧/氮物种，促进细胞外氧化还原稳态。此外，白蛋白可结合铜、铁等氧化还原活性过渡金属离子以减弱芬顿型自由基产生，其炎症条件下的次氯酸清除能力将氧化缓冲与巨噬细胞抗原加工及MHC-II依赖性免疫调控相联系。从生物材料角度，在材料界面维持白蛋白的天然构象可减少调理素化和巨噬细胞清除受体识别，为其炎症调节行为提供分子基础。低白蛋白血症是AMI患者不良预后的独立危险因素，提示白蛋白在梗死后恢复中的病理生理学作用。尽管如此，设计一种既可注射、自修复，又与动态搏动心脏机械相容，且能响应梗死后多方面病理微环境、同时实现实时治疗监测反馈的白蛋白水凝胶，仍是 formidable 挑战。

### 关键技术方法

研究人员采用动态席夫碱（Schiff base）交联策略，通过BSA氨基与戊二醛醛基反应构建pH响应性白蛋白水凝胶（BST），并功能化修饰MRI/CT双模态成像探针；利用原位自由基聚合法制备线粒体靶向的CAT-SOD天然酶级联纳米凝胶（CSDT），通过2-（二甲氨基）乙基甲基丙烯酸酯（2-(dimethylamino)ethyl methacrylate, 2-DM）修饰酶表面双键，再与丙烯酰胺及三苯基膦（triphenylphosphonium, TPP）阳离子单体共聚实现线粒体靶向，将CSDT纳米凝胶负载于白蛋白水凝胶中构建闭环病理响应系统；采用C57BL/6J小鼠左前降支（left anterior descending, LAD）冠状动脉结扎术建立AMI模型，行心肌内注射给药，通过超声心动图评估心脏功能，结合组织病理学、免疫荧光、流式细胞术及RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）分析治疗机制；利用MRI和CT成像及小分子荧光探针示踪实现材料体内动态监测。

### 研究结果

**BST水凝胶的合成与表征。** 研究人员首先合成线粒体靶向的天然酶CSDT纳米凝胶。CSDT纳米凝胶呈球形，水合粒径约240 nm，分散性良好。荧光共定位分析及荧光共振能量转移现象证实CAT和SOD可有效负载于同一纳米颗粒中。傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）分析显示TPP修饰后C═C伸缩振动衰减及P─C键吸收峰出现，证实CSDT复合物的成功合成。通过BSA氨基与戊二醛的席夫碱反应制备BSA蛋白水凝胶，15%、20%和30% BSA溶液均能在加入0.5%戊二醛后形成凝胶。扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）显示所有蛋白水凝胶均具有明确的多孔结构，孔径随BSA含量增加逐渐减小，维持在50–100 μm范围。力学性能测试表明，随着BSA含量增加，水凝胶储能模量（G′）和损耗模量（G″）逐渐增大，15%、20%和30% BSA水凝胶的杨氏模量分别约为1.2、7.5和45 kPa，其中20% BSA水凝胶的杨氏模量接近天然心肌组织。所有配方均表现出剪切稀化行为，证实其可注射性。拉伸测试显示水凝胶可拉伸至原长的3–6倍，20% BSA水凝胶拉伸性能最佳。爆破压力测试显示20%和30% BSA水凝胶均超过900 mmHg，约为15% BSA水凝胶的3倍。综合考虑凝胶化时间、可注射性、拉伸和流变学特性及心脏组织相关生理压力范围，研究人员选择20% BSA水凝胶进行后续验证。

该水凝胶在各种基底上表现出良好的黏附行为，具有优异的可拉伸性和弹性恢复能力。循环拉伸测试显示，在100%以下应变时应力-应变曲线无明显变化，140%应变时仅出现轻微滞后变化，且水凝胶保持结构完整性。自修复行为归因于BSA与戊二醛形成的动态席夫碱键：储能模量在0.1%–65%剪切应变范围内始终高于损耗模量，超过约65%后急剧下降并于300%应变时低于损耗模量；应变恢复至1%后，G′和G″迅速恢复至初始水平，且该可逆破坏-恢复行为在三个循环中保持稳定。切割后10分钟水凝胶即表现出优异的自修复性能，修复后仍保持拉伸性。

负载CSDT纳米凝胶后，水凝胶显示pH响应性释放行为，酸性条件下CSDT纳米凝胶释放速率加快。BST水凝胶可有效清除H₂O₂和·O₂^-，通过SOD-CAT级联将H₂O₂和·O₂^-转化为O₂，缓解心肌缺氧。DPPH·、·OH和ABTS·⁺等额外自由基模型进一步证实，BSA水凝胶虽具有内在自由基清除活性，但CSDT纳米凝胶的掺入显著增强其抗氧化性能。

**BST水凝胶的体外抗氧化和产氧性能。** 以H9C2大鼠心肌细胞和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVEC）为模型细胞的研究显示，BST具有良好的生物相容性，CSDT浓度在20 μg/mL范围内对两种细胞均无毒性，且具有一定促增殖作用。流式细胞术分析显示CSDT未诱导明显细胞凋亡。与无TPP的CSD纳米凝胶相比，CSDT具有更好的线粒体靶向能力，表现为绿色荧光（纳米凝胶）与红色荧光（线粒体）更多重叠。CSDT可通过SOD和CAT的酶级联反应有效清除细胞及线粒体内过量ROS，并将其转化为治疗性O₂，防止ROS损伤线粒体功能和结构。线粒体膜电位检测表明BST可有效防止ROS导致线粒体膜电位降低。SOD-CAT级联反应产生的O₂不仅有效缓解缺氧微环境，还促进HUVEC细胞管腔形成，促进血管生成。BST处理显著上调线粒体自噬标志物LC3B和抗凋亡蛋白BCL-2，表明增强的线粒体自噬和抗凋亡能力可能协同改善缺血应激下心肌细胞存活。

**BST水凝胶的免疫调节和抗炎效应。** 流式细胞术分析显示，与脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）组相比，BST处理后促炎M1表型（CD86⁺）巨噬细胞数量显著减少，抗炎M2表型（CD206⁺）巨噬细胞数量显著增加。免疫荧光染色显示BST处理后诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, INOS）表达显著降低，精氨酸酶-1（arginase-1, ARG-1）蛋白表达显著升高。相关炎症因子测定显示，BST处理后巨噬细胞分泌的促炎因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）显著降低，抗炎因子白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）和转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）水平显著升高。结果表明BST可通过减少ROS和缺氧相关促炎信号调节巨噬细胞炎症反应。

**BST水凝胶的多功能心脏生物成像。** 利用BSA丰富的暴露氨基，通过4-羧基-TEMPO（4-Carboxy-TEMPO, TEMPO）和二泛影酸钠（Sodium diatrizoate, SD）的酰胺化反应分别获得BSA-TEMPO和BSA-SD，再经席夫碱缩合交联构建具有MRI/CT双模态成像能力的BSTG蛋白水凝胶。与BSA蛋白水凝胶相比，BSTG水凝胶注射后心脏MRI信号显著增强，T₁ MRI信号增强约8倍；CT成像显示BSTG水凝胶可有效增强心脏组织CT信号，较单独BSA蛋白水凝胶增强约2.5倍。罗丹明B修饰的BST蛋白水凝胶体内降解追踪显示，心肌原位注射后荧光强度随时间逐渐减弱，3天后急剧下降，但14天内仍有明显荧光，21天后完全消失，该降解过程与AMI组织重塑过程（炎症期0–3天、增殖修复期约7–10天、成熟重塑期>14天至数周）相吻合。

**BST水凝胶对心肌梗死的体内治疗效果。** 通过C57BL/6J小鼠LAD冠状动脉结扎建立MI模型，于建模时行原位注射。超声心动图评估显示，MI组小鼠7天和28天时左心室射血分数（left ventricular ejection fraction, LVEF）均较假手术组显著降低。7天时，BSA和BSD处理未显著逆转LVEF下降，而BSC和BST处理可显著提高MI小鼠LVEF；28天时，基于BSA的蛋白水凝胶处理均显著改善LVEF，其中BST组心肌梗死后心脏功能恢复最为明显。28天生存曲线显示，BST蛋白水凝胶注射后MI小鼠存活率显著改善，BST处理组达到100%存活率。组织学分析显示，BST处理后MI组织炎症细胞浸润显著减少，心室壁显著厚于MI组。Masson染色显示MI后心脏体积增大、室壁变薄、左心室存在胶原沉积，而BST组心肌纤维化程度降低、左心室厚度增加。7天治疗后ROS染色显示BST清除ROS效果最佳；同时，BST通过SOD-CAT级联反应将ROS转化为治疗性O₂，有效降低缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）表达，缓解MI组织缺氧。28天BST治疗后有效改善缺氧、炎症反应和氧化应激，促进CD31和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表达，有利于MI组织血管生成和修复。肝肾功能标志物检测及主要器官H&E染色未见明显异常，证实BST水凝胶优异的生物安全性。

**BST水凝胶加速MI组织修复的机制。** 主成分分析显示MI与BST处理样本RNA-seq数据存在明确分离，鉴定出432个差异表达基因（283个上调，149个下调）。基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析显示差异表达基因主要聚类于趋化和细胞因子介导的信号传导（生物学过程）、细胞因子和免疫受体活性（分子功能）、胶原富集细胞外基质和分泌颗粒（细胞组分）。京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）分析进一步突出细胞因子-细胞因子受体相互作用、自噬和炎症信号通路的显著富集。机制上，BST的SOD-CAT酶级联通过将·O₂^-和H₂O<sub>2假/sub>转化为O2，减弱ROS驱动的损伤相关分子模式（damage-associated molecular pattern, DAMP）释放和后续促炎M1巨噬细胞募集，同时M2标志物如IL-10、TGF-β的上调反映其免疫调节作用。增强的氧合可能驱动内皮细胞STAT3磷酸化并结合Vegfa、Mmp2和Pdgfb启动子，从而增加MI组织新生血管形成，与血管生成通路的上调和功能学血管生成实验结果一致。

### 研究结论

研究人员开发了一种整合线粒体靶向SOD-CAT酶纳米凝胶（CSDT）的血清白蛋白基蛋白水凝胶（BST），旨在通过重塑梗死微环境加速心肌修复。BST水凝胶具有优异的黏附性、可调硬度（1–60 kPa）和快速自修复能力，能够精确模拟心肌力学并在梗死区域维持组织完整性。嵌入的CSDT响应缺氧诱导的pH变化（由乳酸积累引起）而释放，被细胞摄取后定位于线粒体，启动SOD-CAT酶级联反应清除过量ROS并生成O2，从而动态调控细胞内ROS水平和局部氧浓度以逆转缺血微环境。这一双重功能再平衡M1/M2巨噬细胞极化并促进血管生成，促进有效的心肌再生。在AMI小鼠模型中，BST治疗使血管密度增加约2.5倍，将左心室射血分数恢复至约70%，并实现100%存活率，而未治疗组仅为37.5%。此外，通过MRI和CT探针修饰，BST实现多模态成像以可视化梗死区域并实时监测药物释放，允许适应性治疗调整。通过抗炎、抗氧化、促自噬和补氧效应，该多功能水凝胶有效改善复杂梗死微环境，为临床AMI治疗心肌修复提供了有前景的转化平台。</sub>