纳米治疗性靶向p21高表达衰老库普弗细胞增强伴门静脉癌栓晚期肝细胞癌的抗肿瘤免疫

《Advanced Science》：Targeting p21-High Senescent Kupffer Cells Nanotherapeutically Potentiates Antitumor Immunity in Advanced Hepatocellular Carcinoma with Portal Vein Tumor Thrombus

　　

伴门静脉癌栓（PVTT）的肝细胞癌（HCC）患者通常预后显著不良，且治疗选择有限。单细胞RNA测序（scRNA-seq）揭示，在HCC-PVTT的肿瘤微环境（TME）中存在一类富集的衰老库普弗细胞（sKCs），其特征为p21高表达。这些sKCs表现出显著的衰老相关分泌表型（SASP），可促进肿瘤增殖与侵袭，并与癌症相关成纤维细胞（CAFs）发生串扰。为靶向sKCs，研究人员开发了一种仿生纳米递送系统SKEV@AAV。该系统由携带p21特异性短发夹RNA（shRNA）的腺相关病毒（AAV）载体构成，并封装于来源于sKCs的外泌体（SKEV）中。SKEV@AAV可有效下调p21，抑制SASP信号，并破坏sKCs与癌症相关成纤维细胞之间的促肿瘤相互作用。在原位PVTT模型中，SKEV@AAV表现出单药抗肿瘤活性，并减轻了与SASP相关的炎性重塑。此外，研究人员在小鼠脾源性肝转移模型中评估了其与抗PD-1联用的疗效，结果显示SKEV@AAV可降低肿瘤负荷，增强CD8⁺ T细胞浸润，减少调节性T细胞，并促进记忆T细胞分化。上述结果揭示了sKCs在介导HCC-PVTT免疫抑制中的关键作用，并提供了一种可逆转sKCs衰老、重编程TME并最终增强抗肿瘤免疫激活的纳米治疗策略。

该文发表于《Advanced Science》，聚焦晚期肝细胞癌尤其是伴门静脉癌栓（PVTT）的免疫抑制性微环境重塑问题。肝细胞癌是全球癌症相关死亡的重要原因之一，而PVTT是晚期肝癌进展中的关键恶化事件，不仅限制临床治疗选择，还会促进肝内播散和远处转移，因此与极差预后密切相关。尽管免疫治疗已在多种实体瘤中取得进展，但晚期HCC合并PVTT患者对免疫治疗的响应率依然有限，其深层机制尚未完全阐明。既往研究提示，肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制状态是造成治疗抵抗的重要原因，其中巨噬细胞作为最丰富的免疫细胞群体，直接影响抗肿瘤免疫反应的强度与持续性，因此成为HCC-PVTT免疫治疗突破的重要靶点。

在这一背景下，研究人员基于单细胞RNA测序（scRNA-seq）对HCC及PVTT样本进行系统分析，发现一类p21高表达的衰老库普弗细胞（sKCs）在原发灶和尤其PVTT区域中显著富集，并随着疾病进展而增加。这类细胞具有典型衰老相关分泌表型（SASP），不仅通过分泌炎性和促重塑因子促进肿瘤细胞增殖、侵袭，还与癌症相关成纤维细胞（CAFs）形成紧密串扰，从而共同塑造有利于肿瘤生长和免疫逃逸的微环境。基于此，研究人员提出：若能够特异性逆转这类p21高表达sKCs的衰老状态，可能重塑HCC-PVTT中的免疫抑制微环境，并提高抗肿瘤免疫效应。

围绕这一科学问题，研究构建了一种具有同源靶向特性的仿生纳米递送系统SKEV@AAV。该系统采用来源于衰老库普弗细胞的外泌体（SKEV）作为载体，封装携带p21特异性shRNA的腺相关病毒（AAV），从而实现对sKCs的定向递送和p21沉默。结果表明，该系统能够有效下调sKCs中的p21表达，抑制SASP因子分泌，恢复其部分吞噬和抗原呈递能力，并削弱其对肿瘤细胞及成纤维细胞的促肿瘤作用。在体内，SKEV@AAV在原位PVTT模型中表现出明确的单药抗肿瘤效果；在免疫完整的小鼠脾源性肝转移模型中，与抗PD-1联用后可进一步增强CD8⁺ T细胞浸润、减少Treg细胞、促进记忆T细胞形成，显示出显著的协同免疫治疗潜力。总体而言，研究确立了sKCs是HCC-PVTT免疫抑制与基质重塑的重要调控节点，并提出了面向肝脏定向免疫治疗的新策略，具有潜在转化价值。

就关键技术方法而言，研究主要采用四类技术路线：其一，整合公共scRNA-seq数据集（GSE149614）与自建患者验证队列，对非肿瘤肝组织、原发肿瘤及PVTT组织进行单细胞图谱绘制、细胞通讯分析和CNV推断；其二，利用临床配对标本进行H&E及免疫荧光共定位验证；其三，构建AAV-p21 shRNA并以衰老KCs来源外泌体封装，结合TEM、DLS、蛋白质组学、qPCR和共聚焦成像进行纳米制剂表征；其四，在Transwell共培养体系、原位PVTT裸鼠模型及免疫完整脾源性肝转移模型中，联合EdU、ELISA、流式细胞术、TUNEL、Ki67及体内活体成像评估疗效与免疫效应。

以下结合论文结果部分各小节进行解读。

2.1 Single-Cell Transcriptional Atlas Reveals the Enrichment of p21-Highly Expressed sKCs in HCC with PVTT and Their Interactions in the TME
研究人员首先整合20例临床样本的scRNA-seq数据，包括非肿瘤肝组织、原发肿瘤和PVTT样本，构建了HCC-PVTT的单细胞转录图谱。分析显示，库普弗细胞（KCs）在原发肿瘤和PVTT中相较非肿瘤组织更为富集。进一步亚群分析识别出20个KCs亚簇，其中“Aged_Kupffer”亚群具有显著升高的衰老评分和经典衰老标志物p21表达，提示其为衰老KCs。其比例在原发灶和PVTT中逐步升高，并在独立的6例患者验证队列中得到重复证实。细胞通讯分析表明，p21高表达sKCs与恶性肝细胞及成纤维细胞存在紧密互作。临床样本免疫荧光进一步证实，CD68与p21在PT和PVTT组织中存在显著共定位。该部分说明，p21高表达sKCs是HCC-PVTT进展过程中被选择性富集的关键细胞群，并可能参与微环境异常重塑。

2.2 Design and Characterization of a Drug Delivery System Targeting sKCs with High p21 Expression
为实现对sKCs的精准干预，研究人员构建了两种外泌体递送体系：年轻KCs来源的KEV@AAV和衰老KCs来源的SKEV@AAV，二者均负载AAV-p21 shRNA。研究通过阿霉素（DOX）诱导建立sKCs模型，并用TEM、DLS、Western blot、qPCR等方法验证制剂结构、粒径、包封率和标志蛋白表达。结果显示，SKEV@AAV粒径均一、包封效率高，且AAV制备质量良好。SDS-PAGE和蛋白质组学分析显示，SKEV保留了母细胞蛋白特征，并富集跨膜运输、细胞黏附和转运相关蛋白，这为其同源靶向能力提供了分子基础。共聚焦与竞争摄取实验进一步证明，SKEV@AAV在sKCs中的摄取和感染效率显著高于KEV@AAV，而在正常KCs中则相反。该部分证明，SKEV@AAV具备面向p21高表达sKCs的定向递送潜能。

2.3 SKEV@AAV Precisely Reverses Senescence and Blocks the Pro-Tumor Function of sKCs
在功能层面，研究人员利用Transwell共培养和EdU增殖检测评估sKCs的促肿瘤作用。结果显示，sKCs或sTHP-1可显著促进Hepa1-6、CSQT-2和HuH7肿瘤细胞增殖；对CSQT-2进行Bulk RNA-seq后发现，DNA复制、细胞周期及染色体分离相关通路被激活，提示sKCs为肿瘤细胞创造了“高增殖准备”环境。另一方面，SKEV@AAV处理后，sKCs分泌的IL-1α、IL-1β、IL-6和TGF-β等SASP因子显著下降，p21 mRNA大幅下调，MHC-II表达增强，内吞能力明显恢复，说明其衰老和免疫失能状态被逆转。进一步研究表明，sKCs可通过旁分泌作用刺激NIH/3T3和LX-2等成纤维细胞上调MMP2/MMP9并增加IL-6、TGF-β释放，从而推动细胞外基质重塑和侵袭表型形成；SKEV@AAV能够有效抑制这一过程。该部分表明，SKEV@AAV不仅逆转sKCs自身衰老，而且切断其对肿瘤细胞和CAFs的促肿瘤支持网络。

2.4 The Spatiotemporal Distribution and Targeting Enrichment of SKEV@AAV in Tumor Thrombus-Bearing Mice
在体内分布研究中，研究人员首先证实肿瘤癌栓区域CD68⁺细胞伴随高p21表达，提示其为潜在靶细胞。随后经尾静脉注射Cy5标记的AAV、KEV@AAV和SKEV@AAV，并通过IVIS动态监测体内分布。结果显示，SKEV@AAV在病灶区域的富集从6 h开始明显高于对照组，12 h达到峰值；离体成像和qPCR进一步证实其在肿瘤癌栓组织中的蓄积显著高于AAV和KEV@AAV，而在心、脾、肺、肾等组织中信号接近背景水平。共聚焦成像则显示SKEV@AAV信号与p21阳性细胞核周区域高度共定位。该部分证明，SKEV@AAV在体内具备良好的病灶富集与靶向递送能力。

2.5 Verification of the In Vivo Therapeutic Efficacy of Senescence Reversal Strategies in an Orthotopic PVTT Model
在原位PVTT裸鼠模型中，研究人员评估了SKEV@AAV的单药疗效。多次给药后，活体生物发光成像显示SKEV@AAV自治疗中期起即产生持续抗肿瘤效应，至第14天肿瘤信号较PBS组显著下降；离体肝脏成像和肝重也同步降低。分子检测表明，SKEV@AAV使肝组织中p21 mRNA明显下调，并显著减少IL-1α、IL-1β、TGF-β和IL-6等SASP核心因子。肝组织免疫荧光还显示，SKEV@AAV显著减弱CD68⁺细胞中的p21信号。由于裸鼠保留先天免疫但缺失T/B细胞，该部分主要说明SKEV@AAV可通过调控先天免疫相关的sKCs状态抑制PVTT生长，并缓解炎性重塑。

2.6 SKEV@AAV Combined with PD-1 Blockade Significantly Inhibits the Growth of Splenic Metastatic HCC and Prolongs Survival
为评估与免疫检查点抑制联用的潜力，研究人员在免疫完整小鼠脾源性肝转移模型中比较了PBS、KEV@AAV、SKEV@AAV、抗PD-1及联用方案。结果显示，SKEV@AAV单药已优于KEV@AAV，而抗PD-1联合SKEV@AAV则展现最强疗效，肿瘤信号较抗PD-1单药显著下降。机制层面，联用组p21整体水平、MMP2/MMP9表达和SASP因子浓度进一步下降。病理学检查显示联用组肝转移灶显著减少，肝重降低，TUNEL阳性凋亡增加，Ki67增殖指数下降，并最终延长小鼠中位生存时间。该部分说明，逆转sKCs衰老可显著提高PD-1阻断在肝癌肝转移模型中的治疗效果。

2.7 SKEV@AAV Combined with PD-1 Reshapes the Immunosuppressive Liver Microenvironment and Elicits Potent Antitumor Immunity
在免疫机制方面，联合治疗显著提升iNOS和IFN-β等M1样巨噬细胞相关效应分子，降低Arg-1和IL-10等免疫抑制因子；同时增加GZMB和IFN-γ，提示CD8⁺ T细胞细胞毒功能被激活。免疫荧光和流式结果一致表明，联用组MHC-II⁺F4/80⁺抗原呈递型巨噬细胞比例最高，CD80⁺F4/80⁺ M1样巨噬细胞增加，而CD206⁺F4/80⁺ M2样巨噬细胞减少。与此同时，肝组织中CD8⁺CD3⁺ T细胞显著增加，Treg细胞显著下降；肝内效应记忆T细胞（CD62L^?CD44⁺）和外周血中央记忆T细胞（CD62L⁺CD44⁺）均得到富集。该部分表明，SKEV@AAV联合抗PD-1可同时激活先天免疫和适应性免疫，重建有利于持续抗肿瘤应答的肝脏免疫生态。

讨论与结论部分指出，本研究通过单细胞转录组、临床样本验证及纳米递送系统开发，系统揭示了p21高表达sKCs在HCC，尤其是HCC-PVTT肿瘤微环境中的关键调控作用。sKCs在原发灶和PVTT组织中明显富集，并通过SASP介导肿瘤细胞增殖、成纤维细胞活化、细胞外基质重塑及免疫逃逸。基于sKCs来源外泌体构建的SKEV@AAV可借助同源靶向高效递送p21-shRNA，沉默p21并逆转衰老表型，从而抑制SASP、恢复抗原呈递与内吞功能、削弱促肿瘤微环境。进一步地，在免疫完整模型中，该策略与PD-1阻断联用能够增强CD8⁺ T细胞应答、减少Treg、促进记忆T细胞形成并提升整体抗肿瘤疗效。论文同时指出，现阶段仍存在样本量有限、组织整体p21下降机制尚需更精细追踪验证、以及AAV/外泌体平台长期安全性和转化可行性仍需深入评估等局限。

研究结论可概括为：p21高表达衰老库普弗细胞是HCC-PVTT免疫抑制和肿瘤促进性微环境重塑的重要介导者；SKEV@AAV作为一种基于衰老KCs来源外泌体的仿生纳米治疗系统，能够靶向沉默p21、逆转sKCs衰老、重编程肿瘤微环境，并增强抗PD-1治疗所诱导的抗肿瘤免疫活化。该研究为晚期肝细胞癌特别是伴PVTT患者提供了新的机制认识和潜在治疗路径。