小鼠听觉中脑中由侧频带抑制引发的音调拓扑分离性OFF反应

《Journal of Physiology》：Tonotopically distinct OFF responses arise in the mouse auditory midbrain following sideband suppression

　　

感觉信息被解析为离散的拓扑结构域，是感觉加工的一项基本原则。在听觉皮层中，这些结构域会在刺激过程中发生演变，音调的起始与终止可诱发不同的神经活动空间模式。然而，目前尚不清楚这种空间分离最早发生于听觉系统的哪一级，也不清楚听力损失如何影响这类动态过程。研究人员利用清醒小鼠下丘（inferior colliculus, IC）的宽场单光子（single photon, 1P）神经元Ca²⁺成像发现，纯音刺激不仅可在等频带（isofrequency bands）内诱发空间受限的神经活动，还会同时引起侧频带抑制（sideband suppression）。在刺激终止时，偏移反应（offset responses）出现在先前侧频带抑制所在区域，表明即使是简单刺激，也会诱发时空上彼此分离的神经活动模式，以分别表征声音存在与声音终止。由于声音频率在IC中以空间方式编码，这种空间位移使得相对于声音起始产生一种音调拓扑分离性偏移反应（tonotopically distinct offset, tdOFF）。高分辨率双光子（two-photon, 2P）Ca²⁺成像进一步证实，位于侧频带区域的tdOFF神经元在声音呈现期间活动受到抑制，而在刺激终止后其活动升高至高于基线水平，提示反跳性兴奋（rebound excitation）可能参与这种刺激后激活。强噪声暴露——一种常用的听力损失模型——可同时消除侧频带抑制和tdOFF反应。上述结果表明，听力损失可通过改变侧频带活动而深刻重塑声音加工的时空模式。声音诱导损伤后，听觉中脑中侧频带抑制与tdOFF激活的优先丧失，可能通过促进神经元过度活跃而参与听觉过敏（hyperacusis）和耳鸣（tinnitus）的发生。

该文发表于《Journal of Physiology》，聚焦听觉系统中声音起始（ON）与终止（OFF）信号在中脑阶段如何实现空间分离，以及听力损失如何重塑这一时空编码过程。既往研究已知，听觉皮层中声音起始与终止会激活不同的神经网络，OFF反应对于声音时长感知、终止检测及复杂时序线索提取具有重要意义；同时，一些神经元还表现出ON/OFF不对称性，即同一神经元对声音开始和结束的特征频率并不一致。然而，这种空间与频率上的分离究竟在听觉传导通路的哪一级形成，长期并不明确。下丘（inferior colliculus, IC）是脑干听觉信息向丘脑传递前的关键整合中枢，具有稳定的音调拓扑组织（tonotopy），并接受广泛的兴奋性与抑制性输入，因此成为解析这一问题的理想脑区。另一方面，听力损失后中枢增益增强（central gain enhancement）常伴随抑制减弱，但这种变化是否会优先损害OFF通路及其空间表征，尚缺乏直接证据。因此，开展本研究有助于揭示正常听觉时空编码的中脑机制，并为耳鸣、听觉过敏等疾病相关异常兴奋提供解释。

研究人员在清醒成年小鼠中，结合宽场单光子Ca²⁺成像与双光子Ca²⁺成像，系统描记IC对纯音刺激的空间与时间响应模式。研究首先证明，成年小鼠IC背侧表面数百微米深度范围内可通过体内光学方法稳定记录，其中既覆盖中央核的浅层频率表征区域，也可分辨外壳区域的解剖边界。随后，研究人员发现纯音在IC中诱发的并非单一的“开-关”响应，而是由ON反应、刺激期间的适应与抑制、以及刺激终止后的OFF反应共同构成的动态过程。尤其值得注意的是，多数中高频纯音在激活等频带神经元的同时，会在其相邻、偏低频率表征的侧频带区域诱发明显抑制；而在声音结束后，OFF反应恰恰从这一先前受抑区域出现，从而形成与ON反应在空间位置上分离、在音调拓扑上不同的tdOFF模式。进一步的细胞分辨率成像表明，这些tdOFF神经元在刺激期间其Ca²⁺信号低于基线，刺激终止后再升高，提示其生成与抑制后的反跳活动密切相关。最后，研究人员采用强噪声暴露建立听力损失模型，发现尽管阈上ON反应幅度可恢复至接近基线，侧频带抑制与tdOFF却几乎完全消失，说明中枢增益补偿并不能重建这两类关键的时空处理特征。

本研究主要采用以下关键技术方法。其一，利用Allen Institute for Brain Science公开的Mouse Brain Connectivity数据集分析耳蜗核（CN）至IC的前馈投射以及听觉皮层（AC）至IC外壳区的反馈投射，以界定体内成像可及的IC解剖区域。其二，在表达遗传编码Ca²⁺指示器jRGECO1a的成年清醒小鼠中建立IC颅窗，实施单光子宽场Ca²⁺成像，用于观察整个暴露IC表面的音调拓扑与时空动态。其三，采用双光子Ca²⁺成像在细胞分辨率和不同深度水平上记录单神经元及局部神经网活动。其四，应用不同频率、强度及持续时间的调幅纯音刺激，量化ON反应、刺激中抑制与OFF反应之间的关系。其五，采用8–16 kHz窄带强噪声暴露建立听力损失模型，并结合听性脑干反应（auditory brainstem response, ABR）验证外周听阈升高，再比较噪声暴露前后IC成像信号的变化。

在“Major divisions of the mouse IC are accessible to in vivo optical recording methods”部分，研究人员首先从解剖层面确认了体内光学记录的可行性。Allen连接组数据显示，来自耳蜗核的上行投射在IC中央核形成致密终末网，最浅可达距离软脑膜约80–100 μm的位置；而来自听觉皮层的反馈投射主要局限于软脑膜下<100 μm的薄层区域。这表明，小鼠IC中央核的浅表低频区域可被体内单光子和双光子成像直接访问，为后续功能记录奠定了基础。

在“Widefield Ca²⁺ imaging reveals spatiotemporal patterns of sound processing in the IC”部分，研究人员利用宽场成像显示，纯音可在IC背侧表面诱发沿等频带分布的离散Ca²⁺活动区域，并呈现清晰的音调拓扑嵌套格局。低频声音诱发较浅表的响应，高频则逐渐向更深部表征区域过渡。更重要的是，静态峰值图之外，神经活动在时间维度上也高度动态：所有频率的峰值几乎均出现在刺激开始后不久，即典型ON反应；随后信号迅速适应，部分频率尤其是>6 kHz时还会出现低于基线的刺激中抑制；而刺激结束后，多数频率会出现OFF反应，且高频时OFF幅度可接近甚至超过ON。由此证明，IC中的声音加工并非单纯幅度编码，而是由精细的时空演变构成。

在“OFF responses are spatially separated from ON responses”部分，研究人员通过改变刺激持续时间确认，OFF反应是与声音终止严格时间锁定的事件，而非延迟的ON成分。持续时间≥400 ms的刺激后可稳定诱发明显OFF，而1 s刺激最能同时产生峰值抑制和显著OFF。空间分析显示，对于≥6 kHz的多数频率，ON与持续反应由两条活动带构成，而二者之间、位于偏低频表征区的区域出现刺激中抑制；声音结束后，OFF反应则主要出现在该抑制区域，而不是原先的ON带，因此被定义为tdOFF。相比之下，最低频率声刺激几乎不产生明显tdOFF，OFF多与ON区重叠。像素水平相关分析进一步显示，刺激期间抑制越强，后续OFF幅度越大，提示tdOFF与侧频带抑制在机制上存在紧密联系。

在“tdOFF-responding neurons are clustered in sideband regions and inhibited by tones”部分，双光子成像将上述现象推进到细胞分辨率。研究人员发现，对某一频率具有响应的神经元聚集在假定等频层板中，而在其相邻侧频带区域则存在一簇神经元和神经网，在刺激期间Ca²⁺信号被压低至基线以下，刺激终止后出现显著tdOFF。根据刺激期间信号积分排序可见，位于响应层板中心的神经元在整个声音呈现期间持续升高；位于层板边缘的神经元表现出适应性ON/OFF特征；而位于侧频带区域、积分最低甚至为负值的神经元则表现出最典型的“先抑制、后反跳”式tdOFF。单细胞分析同样表明，刺激中抑制强度与OFF幅度显著相关，而ON幅度与OFF幅度相关性较差，支持ON与tdOFF由不同神经元群体承担。

在“ON and tdOFF tonotopy change with depth”部分，研究人员进一步考察了ON与tdOFF在三维空间中的组织方式。通过在同一只动物中结合宽场成像和不同深度的双光子成像，研究发现最浅层约50 μm仅见零散神经元响应，而完整的等频层板、刺激中抑制及tdOFF要到100 μm以下才明显出现，符合浅层外壳区反馈输入较多、中央核上行输入较少的解剖特点。对3.0和4.6 kHz低频音的分析显示，ON响应区域在不同深度形成“V”形构型，而抑制区与tdOFF则嵌套在这一“V”形结构内部、位于偏低频空间。该结果不仅解释了宽场成像中不同频率下响应形态的来源，也说明声音起始与终止的空间编码关系会随深度发生变化。

在“Hearing loss disrupts evoked suppression and tdOFF responses more than ON responses”部分，研究人员利用强噪声暴露模型考察听力损失对IC时空编码的影响。ABR结果证实噪声暴露后小鼠出现显著听阈升高。宽场Ca²⁺成像显示，IC中的声音诱发阈值也相应升高，但在足够高的刺激强度下，ON反应幅度可恢复至暴露前水平，某些高频甚至增强，符合中枢增益增强特征。然而，与ON反应相反，刺激中抑制与OFF反应在噪声暴露后几乎全面消失。原本在刺激期间会跌破基线的频率，暴露后其神经活动在整个刺激过程中均维持升高；原本在声音结束后从侧频带抑制区出现的tdOFF也不再可见。空间剖面分析进一步表明，ON响应位置基本保留，但OFF阶段不再转移至侧频带区域，而是残留在原ON位置附近。这说明听力损失后，IC中表征“声音终止”的时空图景发生了根本性重构。

讨论部分围绕tdOFF的抑制机制、脑干来源及功能后果展开。研究结果支持这样一种模型：IC中的侧频带抑制不仅用于塑造频率选择性，还可能通过诱发超极化后的反跳兴奋，促进tdOFF神经元在声音结束时被激活。文中结合既有证据指出，IC神经元表达超极化激活环核苷酸门控通道（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels, HCN）及T型Ca²⁺通道，具备由抑制转化为反跳放电的生物物理基础。尽管并非所有OFF反应都依赖抑制，但本研究观察到的tdOFF尤其与强侧频带抑制密切耦联，因此最可能代表一种抑制依赖的OFF子型。作者还指出，上游脑干核团如耳蜗核、外侧丘系核和上橄榄复合体也存在OFF反应，因此IC中的tdOFF既可能部分继承自上游输入，也可能在IC内重新整合生成；目前尚难完全区分。功能上，tdOFF为相同声音的起始与终止提供了不同的音调拓扑表征，这可能有助于声音终止检测、时间间隙加工、声音时长感知及方向选择等高级听觉计算。更进一步，听力损失后tdOFF与侧频带抑制优先丧失，意味着中枢增益补偿虽然维持了ON反应，却牺牲了抑制性时空精加工，这种失衡可能促进神经元过度活跃，并参与耳鸣、听觉过敏及声音辨别受损等病理表型。

研究结论部分可概括为：研究人员证明，在正常听觉条件下，小鼠下丘中的纯音刺激可引发与声音起始不同、且在音调拓扑上分离的OFF反应模式；这种tdOFF来源于先前发生侧频带抑制的区域，并与刺激期间的神经抑制强度密切相关。强噪声所致听力损失优先消除侧频带抑制与tdOFF反应，而阈上ON反应可相对保留，表明听力损失深刻改变了听觉中脑中声音加工的时空组织。该发现提示，tdOFF及其相关抑制机制可能是维持正常听觉时序编码的重要基础，其受损可能参与耳鸣与听觉过敏等听力损失相关综合征的发生。