埃塞俄比亚慢性乙型肝炎病毒感染肝硬化患者中存在独特的免疫特征

《Alimentary Pharmacology & Therapeutics》：A Distinct Immune Signature Characterizes Cirrhosis in Ethiopian Individuals With Chronic HBV Infection

　　

背景和目的：非洲地区慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染率居高不下，但该地区患者的免疫细胞表型特征鲜有描述。本研究旨在调查埃塞俄比亚队列中处于四种不同临床病期的患者免疫细胞表型差异。

方法：研究纳入287例未经治疗的HBV感染患者，均排除人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）感染，来自埃塞俄比亚阿达马医院。根据临床参数将患者分为以下组别：低复制期感染、"灰区"、活动性肝炎和肝硬化。采用Cytodelics全血细胞稳定剂冻存全血样本，并使用两组高维流式细胞术面板进行免疫细胞表型分析。

结果：与其他慢性HBV感染阶段相比，肝硬化患者表现出独特的免疫表型，其特征为单核细胞增多、所有淋巴细胞减少，同时自然杀伤（natural killer, NK）细胞、CD4⁺ T细胞和B细胞均出现从成熟表型向初始表型的转变。CD38⁺HLA-DR⁺细胞在淋巴细胞各谱系中的出现定义了肝硬化患者，且这些双阳性细胞的频率与天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）与血小板比值指数（AST to Platelet Ratio Index, APRI）呈正相关，后者作为肝硬化严重程度的评估指标。

结论：埃塞俄比亚HBV相关肝硬化表现出独特的免疫表型，其中CD38⁺HLA-DR⁺ NK细胞和T细胞的频率与肝硬化严重程度密切相关。

本研究发表在《Alimentary Pharmacology》杂志上，聚焦于非洲埃塞俄比亚地区慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者的免疫特征这一长期被忽视的研究领域。尽管世界卫生组织（World Health Organization, WHO）非洲区域每年报告大量HBV新发病例和死亡病例，且埃塞俄比亚慢性HBV感染流行率高达6.0%-6.9%，涉及约700万感染者，但现有免疫学研究主要集中在亚洲和欧洲人群，非洲队列数据严重匮乏。由于环境因素、合并感染和遗传背景存在显著地域差异，深入理解非洲患者的特异性免疫病理机制对于精准制定抗病毒治疗决策至关重要。此外，当前标准治疗虽能抑制病毒复制、降低肝细胞癌和肝硬化等并发症风险，但并非所有患者都需要药物干预，因此明确不同临床阶段的免疫特征对指导治疗具有重要意义。

本研究存在以下亟待解决的问题：非洲HBV感染者的免疫细胞表型特征几乎未知；肝硬化阶段的免疫紊乱机制不清楚；缺乏适用于资源有限地区的大样本免疫学研究方法。研究人员因此开展了这项针对埃塞俄比亚未经治慢性HBV感染者的大规模队列研究，旨在系统刻画从低复制期感染到晚期肝病的完整免疫谱系变化。研究得出结论：埃塞俄比亚HBV相关肝硬化呈现以单核细胞增多、淋巴细胞减少及CD38⁺HLA-DR⁺细胞扩增为标志的独特免疫表型，且该表型与肝硬化严重程度密切相关。这一发现突破了既往研究的地域局限性，为非洲人群的HBV免疫病理机制提供了重要证据，并提示CD38⁺HLA-DR⁺免疫细胞可作为评估肝硬化严重程度的潜在生物标志物。研究成果发表于《Alimentary Pharmacology》。

研究所采用的主要关键技术方法包括：从埃塞俄比亚阿达马综合专科医院肝炎门诊招募287例未经治HBV感染者，排除HIV和HCV感染，依据2017年欧洲肝脏研究学会（European Association for the Study of the Liver, EASL）标准将患者分为低复制期感染、"灰区"、活动性肝炎和肝硬化四组；使用Cytodelics全血细胞稳定剂进行样本采集与冻存，通过干冰运输至斯堪的纳维亚地区进行集中检测；采用两组高维流式细胞术面板（panel 1聚焦广谱免疫细胞亚群鉴定，panel 2包含免疫细胞活化与耗竭标志物）在BD FACS Symphony A5流式细胞仪上进行分析；运用UMAP降维联合Phenograph算法的非监督聚类方法分析NK细胞、CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞亚群；采用Kruskal-Wallis检验及Dunn事后检验进行组间比较，Spearman秩相关分析评估双阳性细胞频率与APRI评分的相关性。

研究结果部分如下。3.1 患者特征：研究队列中位年龄30岁，47%为女性。各组在临床参数上存在显著差异，肝硬化组男性居多（78%），血小板降低，HBV DNA水平升高，LSM显著增高，"灰区"组qHBsAg水平最高。

3.2 HBV感染后期单核细胞频率增加：肝硬化组总单核细胞相对频率显著高于低复制期感染和"灰区"组，中间型单核细胞增加而非经典型单核细胞减少，各亚型HLA-DR表达无差异。树突状细胞频率在各组间无显著变化。

3.3 HBV相关肝硬化中CD56^bright NK细胞富集：肝硬化组NK细胞绝对计数降低，但CD56^bright NK细胞频率显著升高，CD56^dim NK细胞相应减少，提示细胞毒性效应细胞减少而非成熟细胞增多。非监督聚类识别出16个NK细胞簇，肝硬化组以表达HLA-DR、CD39、CXCR5、CD69和KLRG1的第14簇为主，同时CD39、NKG2D和NKp46表达增加。尤为重要的是，CD38⁺HLA-DR⁺ NK细胞在肝硬化组显著增加，主要由CD56^dim NK细胞驱动。

3.4 HBV相关肝硬化中记忆性向初始B细胞亚群转变：肝硬化组B细胞绝对计数显著降低，转换记忆B细胞（CD27⁺IgD^?）减少而初始B细胞（CD27^?IgD⁺）增加，提示抗原再应答能力下降。

3.5 慢性HBV进展过程中CD4⁺ T细胞群体频率变化：肝硬化组CD4⁺ T细胞绝对计数显著降低，终末效应记忆重新表达CD45RA细胞（terminal effector memory cells re-expressing CD45RA, TEMRA）减少而中心记忆细胞增多。非监督聚类广度分析识别出17个CD4⁺ T细胞簇，肝硬化组以表达CCR7、CD45RA、CD27和CD62L的第17簇（提示干样记忆T细胞）及表达OX40、PD-1和CD122的第16簇（提示活化与耗竭并存效应簇）为主。CD38⁺HLA-DR⁺ CD4⁺ T细胞在肝硬化组显著增加，TEMRA亚群中尤为明显。

3.6 HBV相关肝硬化中CD38⁺HLA-DR⁺ CD8⁺ T细胞增加：肝硬化组CD8⁺ T细胞和黏膜相关恒定T细胞（mucosal-associated invariant T cells, MAIT）绝对计数降低，但CD8⁺ T细胞分化阶段无显著差异。非监督聚类识别出16个CD8⁺ T细胞簇，肝硬化组以表达HLA-DR和CD38的第8簇为主。CD38⁺HLA-DR⁺ CD8⁺ T细胞频率在肝硬化组显著升高，TEMRA亚群中更为突出。

3.7 HLA-DR⁺CD38⁺ NK细胞和T细胞频率与肝硬化程度相关： Spearman相关分析显示，HLA-DR⁺CD38⁺ NK细胞（r=0.5482，p<0.0001）、CD4⁺ T细胞（r=0.4121，p=0.0074）和CD8⁺ T细胞（r=0.3840，p=0.031）均与APRI评分呈正相关，提示双阳性细胞频率随疾病严重程度增加而升高。

讨论部分重点阐述了以下核心内容。研究人员指出，肝硬化组表现出与其他病期明显不同的免疫表型，而"灰区"、活动性肝炎和低复制期感染组之间的差异相对较小，这可能归因于肝硬化阶段免疫细胞组成的显著改变。研究观察到各免疫亚群绝对计数减少的现象与既往肝硬化患者常出现淋巴细胞减少的报道一致，而单核细胞增多则符合肝硬化相关免疫功能障碍（cirrhosis-associated immune dysfunction, CAID）的典型特征。更为关键的是，研究发现了从分化细胞向初始免疫表型的集体转变效应：B细胞从CD27⁺记忆型向CD27^?初始型偏移；NK细胞呈现CD56^dim向CD56^bright的转变；CD4⁺ T细胞中TEMRA减少而中心记忆细胞增多；但CD8⁺ T细胞未显示相同分化偏移，这一现象此前亦有报道。

研究人员深入探讨了CD38⁺HLA-DR⁺细胞在肝硬化中的核心意义。该双阳性细胞群是定义CAID的关键特征，此类细胞虽表达活化标志，但同时携带PD-1、CTLA-4和TIM-3等抑制性标志，属于"耗竭性"群体。在慢性HIV感染中，TIM-3与CD38的共表达曾被发现与病毒载量正相关。转录组学层面，HLA-DR⁺CD38⁺ CD8⁺ T细胞虽高表达颗粒酶B和穿孔素，但主要促进肝损伤而非病毒清除，且成功抗病毒治疗后该群细胞减少。本研究中，NK细胞除表达CD38和HLA-DR外，还高水平表达活化性受体NKp46和NKG2D，这些分子既往被报道参与肝脏炎症发展。

研究人员也坦承研究存在若干局限：样本固定处理无法进行功能性分析；横断面设计无法确定免疫动态变化；全血冻存方法可能导致部分标志物（如PD-1）检测不够可靠；小体积血样可能低估低频率细胞亚群的差异；外周血分析未能完全反映肝脏局部免疫变化。但研究优势同样突出：287例大样本量、清晰的临床分期、简化的冻存方法适用于资源有限地区、高维流式细胞术实现了全免疫谱系分析。

研究结论部分翻译如下：在埃塞俄比亚这一未经治慢性HBV感染队列中，肝硬化呈现出以同时存在活化和耗竭为特征的复杂免疫信号。此外，肝硬化相关免疫功能障碍表型以HLA-DR⁺CD38⁺ NK细胞和T细胞群的出现为标志，表明肝硬化对免疫细胞群体的印记在不同种族和不同病因的肝硬化中具有保守性。