线粒体脂肪酸酶CPT1A缺陷是严重哮喘气道上皮屏障功能障碍的潜在机制

《Allergy》：Deficiency of Mitochondrial Fatty Acid Enzyme, CPT1A, Underlies Airway Epithelial Barrier Dysfunction in Severe Asthma

　　

背景：通过肉碱棕榈酰转移酶-1A（CPT1A）进行的线粒体脂肪酸氧化可产生三磷酸腺苷（ATP）。研究人员检测了其在哮喘气道上皮细胞通透性和线粒体代谢稳态调节中的作用。
方法：将来自健康对照和严重哮喘（SA）患者的原代鼻上皮细胞（NECs）在气液界面（ALI）培养体系中，分别暴露于CPT1A小干扰核糖核酸（siRNA）、CPT1A过表达慢病毒或左旋肉碱（LCA）。测量了上皮跨上皮电阻（TEER）和异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran）转运。同时研究了健康与SA受试者的支气管活检组织以及屋尘螨（HDM）哮喘小鼠模型。
结果：在SA患者的NECs-ALI模型和支气管活检组织来源的支气管上皮细胞（BECs）中，CPT1A的表达较健康对照降低。在健康对照的NECs中敲低CPT1A，降低了闭合蛋白（Occludin）和E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达并损害了上皮屏障完整性（EBI）；而在SA患者的NECs中，通过CPT1A过表达慢病毒或LCA上调CPT1A，则增加了屏障蛋白的表达并改善了EBI。在健康的BECs中敲低CPT1A，增加了线粒体活性氧（mtROS）的释放，伴随线粒体结构破坏和细胞外信号调节激酶1/2-核因子κB（ERK1/2-NF-κB）信号通路的激活。这些效应在HDM暴露下加剧，而N-乙酰半胱氨酸（NAC）和线粒体靶向超氧化物歧化酶模拟物（MitoTempo）则降低了磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）和磷酸化P65（p-P65）的激活，并改善了CPT1A敲低和HDM暴露下的EBI。在小鼠模型中，气道上皮CPT1A蛋白表达降低，这与气道高反应性、炎症以及Occludin和紧密连接蛋白-1（ZO-1）表达的减少相关；LCA处理部分逆转了这些效应，并恢复了线粒体完整性和EBI。
结论：CPT1A通过恢复哮喘气道上皮细胞的线粒体功能来维持上皮屏障功能。恢复SA患者缺陷的上皮CPT1A可能代表一种新的治疗途径。

**论文解读：线粒体脂肪酸酶CPT1A缺陷在严重哮喘气道上皮屏障功能障碍中的作用机制**

**研究背景与意义**
哮喘是一种以咳嗽、喘息、呼吸急促和胸闷为特征的慢性气道炎症性疾病，其发病与环境刺激物如屋尘螨（HDM）、花粉和烟草烟雾等引发的2型炎症及后续过程相关。尽管大多数哮喘患者可通过吸入性糖皮质激素（ICS）和长效β₂受体激动剂的联合用药得到控制，但仍有约3%–10%的患者病情严重，即使在高剂量联合治疗下仍无法控制。研究表明，哮喘中存在上皮屏障完整性缺陷和异常的上皮脱落，这代表了气道上皮功能障碍，削弱了抵御外界侵害的第一道防线。上皮屏障功能障碍的指标之一是细胞间接触蛋白——黏附连接（AJs）和紧密连接（TJs）蛋白的表达减少，这使得过敏原、细菌和污染物等外部物质更容易渗透。因此，气道上皮屏障破坏与哮喘疾病的严重程度相关。

气道上皮细胞（AECs）中线粒体稳态对于维持上皮屏障功能至关重要。线粒体通过运输信号分子和调节活性氧（ROS）来调控细胞信号传导。受损的线粒体会释放线粒体损伤相关分子模式（DAMPs）等成分到细胞质或肺部，可能激活模式识别受体，触发Ca²⁺信号和钙蛋白酶，导致连接蛋白去定位。已知线粒体功能障碍也会诱导肠道上皮中ROS介导的屏障破坏，而AECs中E-钙黏蛋白的减少和屏障功能受损与线粒体生物合成减少相关。过量的ROS是哮喘中组织损伤和上皮屏障功能障碍的触发因素，在严重哮喘和急性加重期间，气道中的氧化应激系统性升高。然而，严重哮喘中线粒体功能障碍与上皮屏障损伤之间的具体联系机制尚不清楚。

肉碱棕榈酰转移酶（CPT）1是一种位于线粒体外膜的跨膜蛋白，其中CPT1A是主要亚型，催化脂质代谢的第一步转运，是脂肪酸氧化（FAO）的限速酶，其产物乙酰辅酶A和其他中间体驱动ATP的产生。在2型肺泡上皮细胞中，CPT1A的下调与急性肺损伤有关。CPT1A在哮喘，特别是严重哮喘患者AECs中的潜在稳定作用仍属未知。研究人员假设CPT1A可能与气道上皮损伤相关，因此研究了其在哮喘AECs中的表达及其功能效应。本论文发表于《Allergy》期刊，揭示了CPT1A缺陷在严重哮喘发病机制中的关键作用，为开发新的治疗策略提供了重要靶点。

**关键技术方法概述**
本研究综合运用了多种技术方法。首先，研究人员收集了健康对照、轻中度及严重哮喘患者的临床样本，包括通过鼻刷获取的原代鼻上皮细胞（NECs）和通过支气管镜获取的支气管活检组织。利用气液界面（ALI）培养体系建立了体外上皮屏障模型。通过基因集富集分析（GSEA）挖掘了公共转录组数据集（GSE74075）。在细胞模型中，使用了CPT1A小干扰核糖核酸（siRNA）进行基因敲低，以及CPT1A过表达慢病毒和代谢调节剂左旋肉碱（LCA）进行功能回复实验。功能评估包括跨上皮电阻（TEER）测量、异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran）通透性实验、线粒体呼吸（氧消耗率，OCR）和ATP生成测定、线粒体活性氧（mtROS）检测以及线粒体超微结构透射电镜（TEM）观察。此外，构建了屋尘螨（HDM）诱导的严重哮喘小鼠模型，用于在体验证CPT1A的作用及LCA的治疗潜力。分子机制研究涉及蛋白质印迹（Western blot）、免疫荧光、免疫组化等技术，以分析紧密连接蛋白、信号通路蛋白（如p-ERK1/2、p-p65）及线粒体动力学相关蛋白的表达。

**研究结果**
**2.1 哮喘患者痰细胞、支气管活检和鼻上皮细胞中CPT1A表达降低**
对公共数据集GSE74075的分析显示，哮喘患者痰细胞中脂肪酸代谢及相关基因表达下调，其中CPT1A的表达显著低于健康对照。对21例严重哮喘患者和10例健康对照的支气管组织检查发现，患者气道上皮存在显著破坏，包括细胞间隙增宽。免疫组化染色显示，严重哮喘患者AECs中CPT1A染色强度降低，同时ZO-1和Occludin表达分别减少39.9%和46.2%。患者AECs中CPT1A水平与血清免疫球蛋白E（IgE）水平、血中性粒细胞数和呼出气一氧化氮（FeNO）呈负相关，但与第一秒用力呼气容积（FEV₁）呈正相关。对原代NECs的分析进一步证实，哮喘患者，尤其是严重哮喘患者，其CPT1A信使核糖核酸（mRNA）和蛋白（CPT1A、ZO-1、E-钙黏蛋白）表达均显著低于健康对照。

**2.2 CPT1A表达与气道上皮屏障完整性**
利用原代NECs建立ALI模型发现，严重哮喘来源的模型存在更多间隙和细胞间连接破坏，Occludin和CPT1A表达急剧下降。在健康对照NECs-ALI模型中使用CPT1A siRNA敲低CPT1A基因表达（敲低效率69.56%），导致Occludin、TJ蛋白1和E-钙黏蛋白的基因和蛋白表达下调，同时FITC-葡聚糖通透性增加，TEER降低，表明上皮完整性受损。相反，在严重哮喘患者的NECs-ALI模型中，使用LCA或CPT1A过表达慢病毒上调CPT1A，能够增加紧密连接蛋白（Occludin、TJ蛋白1、E-钙黏蛋白）的基因和蛋白表达，减少屏障泄漏，提高TEER，从而恢复屏障完整性。在CPT1A siRNA处理的健康对照NECs中，LCA也能部分逆转屏障损伤。

**2.3 CPT1A对健康和严重哮喘受试者NECs线粒体功能的诱导**
GSE74075数据集分析显示哮喘患者氧化磷酸化（OXPHOS）水平降低。对原代NECs-ALI的代谢分析表明，CPT1A敲低会降低健康受试者细胞的基底呼吸、最大呼吸和ATP生成。LCA处理可以补偿CPT1A siRNA造成的损伤，增强最大呼吸和ATP生成。在严重哮喘患者的NECs-ALI中，LCA主要减轻了基底呼吸和ATP产生的缺陷。此外，CPT1A敲低增加了健康NECs-ALI中的mtROS释放，而LCA处理可减少mtROS。在严重哮喘NECs-ALI中，LCA同样降低了线粒体氧化应激。这些结果表明CPT1A通过维持线粒体稳定性发挥保护作用。

**2.4 CPT1A在HDM诱导的哮喘小鼠模型中的作用**
在HDM诱导的哮喘小鼠模型中，气道上皮CPT1A表达显著降低，并伴有炎症增加、气道高反应性（AHR）升高、支气管肺泡灌洗液（BALF）中炎症细胞（巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞）和细胞因子（肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-4（IL-4）、IL-6、IL-17A、IgE）水平上升。LCA治疗部分恢复了CPT1A表达，降低了AHR、炎症细胞浸润、细胞因子水平、杯状细胞化生和组织纤维化。透射电镜显示，HDM暴露小鼠AECs中线粒体出现水肿、空泡化，嵴断裂或减少，而LCA预处理恢复了线粒体完整性。同时，HDM暴露降低了小鼠气道上皮中Occludin和ZO-1的表达，LCA处理则使其表达增加。值得注意的是，LCA注射对正常小鼠的气道上皮屏障完整性无显著影响，提示其治疗作用可能依赖于哮喘个体中预先存在的代谢缺陷。

**2.5 CPT1A通过mtROS-ERK1/2-NF-κB通路介导上皮屏障保护**
在HDM刺激的健康人BECs模型中，敲低CPT1A（使用短发夹核糖核酸（shRNA））会降低ZO-1和Occludin蛋白水平，增加屏障通透性。CPT1A敲低和HDM暴露具有协同破坏作用。CPT1A敲低导致mtROS释放增加，线粒体质量减少，并破坏线粒体动力学平衡（融合蛋白视神经萎缩蛋白1（OPA1）和线粒体融合蛋白2（MFN2）减少，裂变蛋白动力相关蛋白1（DRP1）和线粒体裂变1蛋白（FIS1）增加），HDM暴露加剧了这些变化。LCA处理可以逆转这些异常，减轻线粒体功能障碍和氧化应激。抗氧化剂NAC和MitoTempo能够恢复被HDM降低的超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）含量，并挽救HDM暴露的BECs（无论是否敲低CPT1A）中ZO-1、E-钙黏蛋白和Occludin表达的减少。机制上，HDM诱导了p-ERK1/2的激活，进而增强了下游p-p65的核转位。CPT1A敲低在HDM挑战下加剧了ERK1/2-NF-κB通路的激活，而NAC和MitoTempo可以逆转这种激活。使用ERK1/2抑制剂（SCH772984）和NF-κB抑制剂（BAY 11-7082）也能有效逆转由CPT1A缺陷和HDM诱导的屏障破坏。因此，HDM诱导的支气管上皮屏障损伤可能归因于一条CPT1A可调节的mtROS-ERK1/2-NF-κB依赖性通路。

**讨论与结论总结**
讨论部分指出，本研究证据表明线粒体脂肪酸酶CPT1A在维持气道上皮完整性中扮演重要角色，其在严重哮喘患者气道上皮中的缺陷可能导致功能障碍的上皮屏障。首先，与健康对照和轻中度哮喘相比，严重哮喘患者AECs（包括支气管活检和ALI培养的鼻上皮细胞）中CPT1A的基因和蛋白表达显著降低，HDM哮喘小鼠模型中也观察到类似现象。功能上，敲低健康上皮细胞的CPT1A会减少连接蛋白表达并损害屏障完整性；而上调严重哮喘上皮细胞的CPT1A（通过LCA或过表达）则能增加连接蛋白表达并改善屏障功能。在HDM小鼠模型中，LCA还能减轻炎症和气道高反应性。因此，CPT1A在维持气道上皮完整性和发挥抗炎作用方面均很重要。

机制上，CPT1A敲低和HDM暴露会导致mtROS释放增加和线粒体结构稳定性降低。CPT1A的阻断导致结构蛋白失衡和mtROS增加，提示CPT1A在维持线粒体结构完整性中具有保护作用。线粒体靶向抗氧化剂MitoTempo和ROS抑制剂NAC减轻了HDM暴露的CPT1A缺陷细胞的细胞间连接损伤，将CPT1A相关的mtROS与屏障完整性联系起来。研究人员进一步阐明了ERK1/2/NF-κB通路连接了mtROS和细胞间黏附相互作用。阐明调控CPT1A-mtROS-ERK1/2-NF-κB信号通路的机制，可能成为恢复屏障完整性的一种有前景的治疗策略。

研究还证实了哮喘患者上皮屏障损伤与其AECs中CPT1A代谢水平降低相符。通过ALI模型，研究人员证明CPT1A缺失（无论是遗传操作还是疾病本身导致）引起的mtROS增加、线粒体呼吸和ATP产生减少，可被CPT1A过表达和LCA逆转。AECs具有相当大的生物能量需求以充分应对环境变化，其再生需要向FAO的代谢转变，以调节分化和屏障修复。通过操纵ALI模型中的CPT1A水平，本研究扩展了对体外旁细胞间隙形成和细胞紧密连接变化的理解，并指出AECs中观察到的线粒体损伤和能量缺陷可能是哮喘发病机制的关键驱动因素。

作为FAO的关键启动子，敲低CPT1A对健康对照上皮细胞ALI模型的氧消耗率（OCR），尤其是OXPHOS相关的ATP生成有显著影响。另一方面，LCA对哮喘ALI上皮细胞的细胞内FAO-OXPHOS过程有显著的修复作用，随后改善了屏障完整性。这些发现揭示了CPT1A的线粒体调节功能，并强调了激活的CPT1A-FAO通路作为未来严重哮喘临床管理的一个有希望靶点。大规模代谢组学研究也报告了严重哮喘患者痰液和支气管刷检样本中FAO的减少，与此结论相互印证。

尽管使用鼻上皮细胞作为下呼吸道AECs的代表存在局限性，且LCA除增强CPT1A相关FAO外还有其他代谢功能，但本研究结果表明，CPT1A缺陷在哮喘AECs中诱导的代谢受损导致了AJs和TJs的破坏。恢复CPT1A表达可通过mtROS-ERK1/2-NF-κB信号通路恢复线粒体结构和功能，从而在哮喘AECs中保护AJs和TJs。这项工作可能为维持和恢复哮喘上皮屏障确定了一条新的可靶向通路。

**结论部分翻译：**
CPT1A通过恢复哮喘气道上皮细胞的线粒体功能来维持上皮屏障功能。恢复严重哮喘患者缺陷的上皮CPT1A可能代表一种新的治疗途径。