基于循环肿瘤细胞评估三阴性乳腺癌与上皮性卵巢癌患者抗体偶联药物靶点表达的工作流程

《The Journal of Liquid Biopsy》：A Workflow for Assessing Antibody-Drug Conjugate Target Expression on Circulating Tumour Cells from Triple-Negative Breast Cancer and Epithelial Ovarian Cancer Patients

　　

背景
抗体-药物偶联物（antibody–drug conjugates，ADCs）正在改变实体肿瘤的治疗格局。三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）和上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）中，患者筛选及ADC疗效均受靶抗原表达影响，而此类表达通常具有异质性。单次组织活检无法捕捉这种空间异质性，因此亟需可用于治疗指导的实时评估手段。循环肿瘤细胞（circulating tumour cells，CTCs）可作为微创生物标志物，反映ADC靶点表达。本研究旨在评估TNBC和EOC中临床相关ADC靶点在CTCs上的可检测性。

方法
研究人员选择了ADC靶点TROP-2（用于TNBC）和FRα（folate receptor alpha，叶酸受体α，用于EOC），并纳入新兴靶点PD-L1（programmed death-ligand 1，程序性死亡配体1）和CLDN6（claudin-6，紧密连接蛋白6）。采用流式细胞术（flow cytometry）对3种TNBC细胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-468、HCC1937）和3种EOC细胞系（SKOV3、OVCAR3、Kuramochi）的表面靶抗原表达进行表征。利用Parsortix?系统开展细胞加样回收实验（cell spike-in assays），以优化盒内固定与染色条件，随后将该条件应用于患者来源样本的CTC富集和免疫染色。

结果
流式细胞术显示，不同细胞系之间存在异质性的抗原表达。在TNBC中，TROP-2呈一致表达，包括在EpCAM低表达的MDA-MB-231细胞中亦然，而FRα表达极低或缺失。PD-L1在MDA-MB-231和HCC1937中高表达，但在MDA-MB-468中表达较低。在EOC中，FRα和TROP-2可在SKOV3和OVCAR3中检测到，但在Kuramochi细胞中表达较低或缺失。加样回收实验确认，经Parsortix?富集后，可在盒内检测到TROP-2、FRα和PD-L1。在患者样本中，研究人员于TNBC中鉴定到TROP-2⁺ CTCs，于EOC中鉴定到FRα⁺ CTCs。

结论
本研究证明，利用非表位依赖性（epitope-independent）富集，可行地对CTCs上的ADC靶点开展实时评估。TROP-2在检测TNBC中EpCAM低表达CTCs方面显示出额外价值。将ADC靶点标志物整合入CTC工作流程，或可实现对靶点表达的监测，并有望指导TNBC和EOC中的治疗决策。

该论文发表于《The Journal of Liquid Biopsy》，围绕抗体-药物偶联物（antibody–drug conjugates，ADCs）时代下液体活检在精准分层中的应用需求，建立并验证了一套基于循环肿瘤细胞（circulating tumour cells，CTCs）的靶点检测流程，用于评估三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）及上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）患者体内与ADC治疗密切相关的靶抗原表达。研究背景在于，TNBC和EOC均属侵袭性较强、复发率高、易产生耐药且总体生存不佳的实体肿瘤。尽管TROP-2、FRα等靶向ADC已在相关适应证中显示出显著临床获益，但ADC疗效高度依赖肿瘤细胞表面靶抗原的存在及其表达水平，而这类表达在患者间、病灶间乃至同一病灶内部均具有明显异质性，并可在治疗压力下动态演变。传统单次组织活检仅提供静态、局部的分子图谱，难以反映空间与时间维度上的靶点变化，因此亟需一种能够实时、微创、动态反映靶点可及性的检测策略。CTCs作为来源于原发灶和转移灶的活体肿瘤细胞，具备成为ADC靶点液体活检载体的潜力。

研究人员据此设计研究，重点评估TNBC相关靶点TROP-2、EOC相关靶点FRα，并进一步考察PD-L1和CLDN6等新兴或联合治疗相关标志物在CTCs上的可检测性。研究总体结论为：基于Parsortix?的非表位依赖性富集结合多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence）染色，可实现对TNBC和EOC患者CTCs上临床相关ADC靶点的检测；TROP-2在EpCAM低表达TNBC模型中仍稳定表达，提示其不仅可作为ADC治疗靶点，还可辅助识别表型异质性CTCs；在患者样本中已成功检出TNBC的TROP-2⁺ CTCs和EOC的FRα⁺ CTCs，说明该流程具有临床转化可行性。研究的重要意义在于，为ADC治疗前后的动态靶点评估、耐药机制监测及联合治疗分层提供了可实施的液体活检技术框架。

本研究主要技术方法包括：首先采用流式细胞术分析3株TNBC细胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-468、HCC1937）和3株EOC细胞系（SKOV3、OVCAR3、Kuramochi）的EpCAM、TROP-2、FRα、PD-L1与CLDN6表面表达特征；随后将肿瘤细胞加样至健康供者全血中，使用Parsortix? PR1微流控系统进行CTC富集，并优化盒内固定和免疫荧光染色条件；最后将该流程应用于患者外周血样本。患者队列来源于St. James’s Hospital, Dublin，包括转移性TNBC患者6例及晚期Ⅲ期EOC患者3例，均采集7.5 mL外周血并于4小时内处理。统计学分析基于单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey事后多重比较。

在研究结果部分，论文首先以“Expression of ADC targets in TNBC cell lines”为题，系统比较了TNBC细胞系中各ADC相关靶点的表达异质性。结果显示，EpCAM在MDA-MB-468、HCC1937及对照细胞MCF-7中高表达，而MDA-MB-231仅约31%阳性，证实TNBC中存在典型的上皮表型减弱现象。FRα在TNBC中基本缺失，仅MDA-MB-468存在一定水平阳性。与此相对，TROP-2在所有TNBC细胞系中均呈普遍阳性，尽管几何平均荧光强度（geometric mean fluorescence intensity，gMFI）存在差异，但其跨细胞系的高检出率提示TROP-2具有较强的广泛适用性。PD-L1则表现为明显异质性，在MDA-MB-231和HCC1937中高表达，在MDA-MB-468中接近阴性，提示免疫检查点相关表型具有亚型差异。

在“Expression of ADC targets in EOC cell lines”部分，研究人员进一步分析EOC细胞系中的靶点表达谱。结果显示，EpCAM在OVCAR3和SKOV3中较高，而Kuramochi明显较低，提示EOC同样存在影响表位依赖性捕获的表型异质性。FRα在OVCAR3和SKOV3中呈中高水平表达，而Kuramochi较低。TROP-2在SKOV3中最高，在OVCAR3中可检测，但Kuramochi基本缺失。CLDN6因所用抗体识别胞内表位且检测条件为非透化状态，未观察到明确表面表达，因此该部分结果主要提示现有检测设置尚不足以支持CLDN6进入本研究工作流程的常规分析。

在“Antigen independent capture and immunofluorescent staining”部分，研究人员将经流式鉴定后的代表性细胞系加入健康供者血液中，验证经Parsortix?富集后能否在盒内完成靶点检测。TNBC模型中，3株细胞系均可被识别为上皮标志物阳性并显示TROP-2信号；MDA-MB-231等细胞亦显示PD-L1可被检测。该结果说明在不依赖EpCAM捕获的前提下，富集后的细胞仍可通过多重荧光方案识别肿瘤来源并检测ADC靶点与免疫标志物。EOC模型中，Kuramochi、OVCAR3和SKOV3均可在盒内被识别并检测到FRα信号，而SKOV3还验证了TROP-2染色可行性。该部分证明优化后的流程可兼顾富集效率、形态学判读与靶点可视化。

随后，在患者样本验证部分，研究人员将优化后的流程应用于小规模先导性临床队列。EOC患者样本中，CTCs被定义为Hoechst⁺/EpCAM⁺/panCK⁺/CD45^-细胞，并在全部3例EOC患者中检测到FRα表达。TNBC患者样本中，则检测到TROP-2⁺ CTCs。该结果直接证明了该流程不仅适用于细胞系加样实验，而且能够在真实患者外周血样本中识别具有临床相关性的ADC靶点表达。

讨论部分强调，本研究的核心价值在于提出了一个能够应对肿瘤靶点时空异质性的CTC检测方案。Parsortix?依据细胞大小和可变形性进行非标记富集，避免了EpCAM依赖方法在EMT相关或EpCAM低表达CTCs中的漏检问题，这一点在MDA-MB-231和Kuramochi等模型中得到支持。TROP-2在EpCAM低表达TNBC细胞中的持续表达，进一步提示其兼具治疗靶点与辅助检测标志物的双重价值。PD-L1与TROP-2的共评估为ADC联合免疫治疗的患者分层提供了方法学依据，但作者也指出，当前四通道荧光显微系统限制了更多共表达分析。对于CLDN6，作者明确认为当前结果受限于抗体表位选择，尚需针对胞外表位进一步优化。研究同时指出，小样本量、横断面单时间点设计、未与配对组织免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）及临床结局进行相关分析，是本研究的主要局限，因此后续需在更大样本、纵向随访和组织-CTC配对框架下验证其预测与预后价值。

研究结论部分可译为：本研究证明，在TNBC和EOC中，采用非标记依赖性富集结合多重免疫荧光技术评估CTCs上的ADC靶点，在技术上是可行的。该工作流程能够对经微创采血获得的活体肿瘤细胞同时评估多种临床相关靶点，包括TROP-2、FRα以及免疫检查点标志物PD-L1。随着ADC治疗版图的持续扩展，未来需将基于CTC的靶点监测以前瞻性方式整合入临床试验设计，并设置预定义采样时间点及与疗效相关的终点，以验证该方法在指导临床治疗实践中的应用价值。