应用新型高效液相色谱–激光激发荧光法(HPLC–LSF)分析精浆氨基酸谱与精液质量的相关性研究

《Journal of Assisted Reproduction and Genetics》：Novel HPLC–laser-stimulated fluorescence profiling of seminal plasma amino acids linked to ejaculate quality

　　

目的：氨基酸(AAs)是重要的生物分子，可为精子功能状态提供重要信息，但精浆中氨基酸水平及其与精子特征的关系尚不清楚。方法：研究人员首次采用高效液相色谱(HPLC)联合激光激发荧光(LSF)检测系统，对30份正常精子症(normozoospermia)及51份非正常精子症(non?normozoospermia)供者的精浆氨基酸谱进行测定，同时评估精子参数及DNA完整性，并分析其与各氨基酸的相关性。结果：HPLC–LSF系统共检出精浆中18种氨基酸，除天冬氨酸(aspartate)外，两组间所有氨基酸差异均具统计学意义(p < 0.05)，非正常精子症组中氨基酸相对信号强度显著低于正常组。主成分分析(PCA)及偏最小二乘判别分析(PLS?DA)显示两组氨基酸谱可形成明显聚类，通路分析提示两组间氨基酸代谢通路存在差异。结论：HPLC–LSF平台可作为精浆氨基酸定量的潜在工具，非正常精子症者精浆氨基酸丰度降低可能源于代谢通路异常，提示氨基酸在男性不育中具有重要作用。

论文解读：应用新型高效液相色谱–激光激发荧光法(HPLC–LSF)分析精浆氨基酸谱与精液质量的相关性

研究背景

人精浆含有果糖、胆固醇、蛋白质、氨基酸(amino acids, AAs)、抗氧化酶及矿物质等多种代谢产物，其中氨基酸不仅是蛋白质合成原料，还参与抗氧化、渗透压调节及为精子提供氧化底物以维持代谢。已有研究表明精浆氨基酸水平与精子活力、顶体反应及DNA完整性有关，膳食或体外添加特定氨基酸可改善精液质量。然而，传统氨基酸检测方法（如HPLC–UV、GC–MS、LC–MS/MS）存在低丰度组分检测灵敏度不足、基质干扰大、衍生化复杂或仪器昂贵等问题，精浆这类复杂生物基质中痕量氨基酸的准确定量仍具挑战。此外，精浆氨基酸整体谱与不同精液参数异常（少精子症oligozoospermia、弱精子症asthenozoospermia、畸形精子症teratozoospermia及其复合类型）之间的系统性关联尚未得到充分阐明。因此，研究人员开展本研究，旨在利用高灵敏度HPLC–激光激发荧光(laser?stimulated fluorescence, LSF)技术建立精浆氨基酸谱，比较正常与异常精液人群的差异，探讨氨基酸与精子参数及DNA完整性的相关性，并分析相关代谢通路，为男性不育的代谢机制研究和潜在诊断标志物提供依据。本文发表于Journal of Assisted Reproduction and Genetics。

主要关键技术方法

研究人员收集2020–2023年至印度Kasturba医学院男科实验室行不育筛查男性的精液标本，按WHO(2010)标准分为正常精子症组（n＝30）与非正常精子症组（n＝51，含少精子症n＝33、少弱精子症oligoasthenozoospermia n＝11、少弱畸精子症oligoasthenoteratozoospermia OAT n＝7）。禁欲2–7天后取精，液化后按标准流程行浓度（Makler计数室）、活力（光学显微镜≥200个精子）、活率（伊红?苯胺黑法eosin?nigrosin staining）及形态学（Shorr染色）评估；精子DNA碎片采用精子染色质扩散(sperm chromatin dispersion, SCD)试验检测。精浆经1000×g离心15 min分离，－80 ℃冻存。样品用碳酸氢钠缓冲液按1∶300稀释，丹磺酰氯(dansyl chloride, Dns?Cl)衍生后，以HPLC–LSF系统（Agilent 1200系列，C₁₈反相柱，醋酸盐缓冲液–甲醇梯度洗脱，325 nm He?Cd激光激发，530 nm收集荧光）检测氨基酸。数据经基线校正和平滑预处理，用Jamovi及MetaboAnalyst 6.0行Mann?Whitney U检验、Spearman相关分析、主成分分析(principal component analysis, PCA)、偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS?DA)及变量投影重要性(variable importance in projection, VIP)评分，绘制ROC曲线并做KEGG通路富集分析。

研究结果

精液特征：正常组与异常组各项精液参数符合分组定义，详细数据见补充材料。

精浆氨基酸的检测：HPLC–LSF从精浆中检出18种氨基酸，通过与标准氨基酸色谱图比对完成定性鉴定。

正常与非正常精子症组间氨基酸信号强度比较：除天冬氨酸外，其余17种氨基酸峰强度在非正常精子症组均显著低于正常组（p＜0.001，Mann?Whitney U检验）。各非正常亚组（O、OA、OAT）多数氨基酸中位数亦低于正常组，部分氨基酸（如天冬氨酸、色氨酸tryptophan、半胱氨酸＋胱氨酸cysteine＋cystine）呈现亚组特异性差异，提示整体降低是共性改变，个别氨基酸变化与精子缺陷类型相关。

多元统计分析：PCA三维得分图显示两组沿前三个主成分（累计解释86.6％、4％、2.5％方差）可区分；PLS?DA模型进一步改善分离效果。支链氨基酸(branched?chain amino acids, BCAAs：亮氨酸leucine、异亮氨酸isoleucine、缬氨酸valine)及丙氨酸(alanine)、丝氨酸(serine)、组氨酸(histidine)的VIP＞1，是对分组贡献最大的氨基酸。

相关性分析：Spearman分析显示甘氨酸(glycine)、丝氨酸、丙氨酸、BCAAs、脯氨酸(proline)、谷氨酸(glutamate)、谷氨酰胺(glutamine)、苏氨酸(threonine)、羟脯氨酸(hydroxyproline)、苯丙氨酸(phenylalanine)、赖氨酸(lysine)、组氨酸等与精子浓度呈中度正相关（r＝0.50–0.64，p＜0.001）；上述部分氨基酸与精子活力呈中度正相关（r＝0.42–0.46，p＜0.01），丝氨酸还与正常形态正相关（r＝0.45，p＜0.01）；BCAAs、甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸与SCD检测结果呈弱负相关（r＝－0.30至－0.36，p＜0.01），即氨基酸较高时DNA碎片率偏低。

受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线分析：以精浆氨基酸相对丰度为特征构建PLS?DA分类模型，组氨酸、亮氨酸、丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸组合对正常与非正常组的区分AUC达0.96（95％置信区间良好），敏感度88.2％，特异度96.6％；各亚组模型AUC均＞0.96。

通路分析：基于KEGG的通路富集识别出10条显著改变通路，影响较大的包括甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢（impact 0.47）、苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸生物合成（impact 0.5）、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢（impact 0.31）、苯丙氨酸代谢（impact 0.36）、组氨酸代谢（impact 0.22）等，提示非正常精子症精浆氨基酸改变涉及多条与氧化还原平衡及能量代谢相关的通路。

讨论与结论总结

研究人员指出，HPLC–LSF具备飞摩尔(femtomole)级检测限，仅需微量样本，较传统方法更适合精浆低丰度氨基酸分析。非正常精子症精浆多数氨基酸显著降低，可能与附属性腺或睾丸代谢活性改变致合成减少/消耗增加有关。BCAAs、丙氨酸、丝氨酸、组氨酸是区分两组的关键氨基酸，其通过参与三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循环供能、一碳代谢(one?carbon metabolism)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)合成及蛋白翻译后修饰等途径影响精子发生、线粒体ATP产生、抗氧化防御及DNA完整性，这与本研究观察到的浓度、活力、形态及SCD相关性相符。五氨基酸组合诊断效能优异（AUC 0.96），结合常规精液分析有望辅助评估不明原因或少弱畸形精子症患者的代谢异常。通路分析揭示甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸、芳香族氨基酸生物合成及组氨酸代谢等通路显著紊乱，为后续功能研究提供线索。研究局限包括总样本量偏小及各非正常亚组分布不均、未收集饮食营养摄入信息。

结论（译文）：氨基酸谱分析是研究男性不育相关代谢差异的有前景的方法。将代谢谱分析与临床精液参数评估相结合，可使临床医生超越传统标志物，更全面地理解精子病理的潜在生物学机制。本研究发现HPLC–LSF平台可用于精浆氨基酸定量；非正常精子症男性精浆氨基酸相对丰度降低可归因于异常代谢通路，强调了氨基酸在男性不育中的意义。