《Journal of Molecular Endocrinology》：Pancreatic β-cell aging in physiology and diabetes: emerging roles of m6A mRNA methylation
胰腺β细胞对葡萄糖稳态至关重要，尤其易受年龄相关应激的影响。衰老是一个基本的生物学过程，其特征为组织和器官功能的进行性衰退，并由多个相互关联的标志所定义。在1型和2型糖尿病中，衰老进程加速——表现为DNA损伤反应、内质网应激和线粒体功能障碍，共同驱动β细胞功能障碍和衰老。N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中最普遍的内部信使RNA（mRNA）修饰。新出现的证据表明，m6A水平随年龄增长以组织特异性的方式发生变化，促进细胞功能障碍和年龄相关疾病。在胰腺β细胞中，m6A低甲基化通过包括胰岛素样生长因子1（IGF1）和胰岛素信号通路在内的机制损害细胞身份、存活和功能。了解老化β细胞中m6A甲基化的调控机制可能揭示旨在保护β细胞功能群和促进健康衰老的新治疗策略。本综述关注生理和糖尿病条件下的胰腺β细胞衰老，并探讨m6A甲基化在衰老和糖尿病进展中的新兴作用。
引言
衰老是一个复杂的生物学过程，其特征是细胞和生理功能的进行性退化，伴随分子和细胞器损伤的积累。这种衰退增加了对多种慢性疾病的易感性，包括糖尿病等代谢性疾病。在分子层面，衰老被定义为十二个公认且相互关联的标志：基因组不稳定性、端粒磨损、表观遗传改变、蛋白质稳态丧失、巨自噬失能、营养感应失调、线粒体功能障碍、细胞衰老、干细胞耗竭、细胞间通讯改变、慢性炎症和菌群失调。生理（生物）年龄描述了个体相对于实际年龄的当前生物学状态，但个体因环境暴露、生活方式和遗传因素的影响而以不同速率衰老。当这些影响不成比例地加重衰老的核心标志时，可驱动过早的功能衰退和更早的疾病发作，符合加速衰老的特征。研究这些标志在生理性老化和病变组织中的表现有助于界定衰老生物学与年龄相关病理之间的联系。
胰腺胰岛尤其易受衰老相关机制的影响。胰岛分泌多种激素（胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胃饥饿素和胰多肽）以维持葡萄糖稳态。随着年龄增长，胰岛发生形态和代谢变化，导致葡萄糖稳态的系统失调。产生胰岛素的β细胞尤其受到年龄相关变化的影响，损害葡萄糖处理能力并促进糖尿病病因。
除经典衰老标志外，表观转录组调控已成为影响细胞衰老的新机制。表观转录组修饰是不改变核苷酸序列的RNA化学修饰，已成为通过不同机制调控RNA的重要调节因子。在目前已发现的170种表观转录组修饰中，N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中最丰富的修饰，约影响哺乳动物转录本中0.1–0.4%的腺苷（每个mRNA约3–5个腺苷）。m6A位点富集于3'非翻译区（3'UTR）的终止密码子附近，控制多种过程，包括mRNA剪接、衰变、转运、储存和翻译效率。单细胞测序技术（如DART-seq）的发展揭示了广泛的细胞m6A异质性，大多数检测到的m6A位点（约88%）发生在小部分细胞（约20%）中。
多项证据表明，m6A修饰促进衰老过程并影响年龄相关慢性疾病的发病。对脑、骨组织、骨骼肌、心脏、血液和视网膜上皮细胞的表观转录组分析显示，在年龄相关慢性疾病模型（阿尔茨海默病、老年性骨质疏松、糖尿病性心肌病和视网膜病变）中m6A水平降低。这些研究共同表明，m6A图谱在生理性衰老和年龄相关慢性疾病中均发生重塑。此外，最近的研究结果表明，m6A修饰调控β细胞生物学的关键方面，包括分化、身份、存活和功能，使得m6A失调成为衰老和糖尿病特征性β细胞功能障碍的合理促成因素。
本综述探讨了不同衰老标志（包括m6A）对生理和糖尿病相关胰腺β细胞衰老的贡献。理解这些过程之间的重叠和差异可能有助于确定在衰老和疾病期间保护β细胞功能的策略。
β细胞的生理性衰老
胰腺β细胞在葡萄糖稳态中发挥至关重要的作用：它们合成、储存和释放胰岛素，从而将血糖浓度维持在一个狭窄的生理范围内。对人类和啮齿类动物的多项研究揭示了随衰老发生的胰岛素分泌减少，这与β细胞的功能和分子变化有关。年龄依赖性的胰岛素释放受损也与小鼠和人类β细胞中Ca2+动态的变化有关。在老年小鼠和人类胰岛中观察到Ca2+动态协调和间隙连接耦合的下降。这些钙信号改变与β细胞进行性线粒体功能障碍有关。同时，β细胞再生能力也下降，因为长寿β细胞的更新率较低且在衰老过程中进一步降低，它们响应代谢需求而增殖的能力在老年人中也显著降低。小鼠中也观察到类似的增殖能力下降，尽管小鼠β细胞与人类相比复制率较高：在50%部分胰腺切除术后，2月龄小鼠每日增殖增加1.62%，而19月龄小鼠仅增加0.01%，证实了衰老过程中β细胞再生能力的降低。
衰老的β细胞还表现出与细胞未成熟、β细胞转录因子网络重塑和转录噪声增加相关的转录失调。对来自8名供体（1-54岁）的2544个胰腺细胞的单细胞转录组学分析显示了与实足年龄相关的高异质性——老年供体细胞中个体基因表达的变异较高，表明转录噪声增加和遗传错误的积累。此外，已发表的单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究的荟萃分析确定了老年供体组（>60岁）β细胞基因转录率的显著下降。
β细胞中细胞衰老的增加是另一个被广泛记录的衰老标志。为识别衰老的分子触发因素，两个关键信号通路p53/p21cip1/waf1（指示细胞应激的早期衰老标志物）和p16Ink4a/Rb（指示复制耗竭的晚期衰老标志物）已被广泛研究。在年轻小鼠（3-4个月大）的亚群β细胞中检测到多种衰老表型（SA-β-Gal活性、p16Ink4a和p53BP1表达增加），这些衰老β细胞的比例随年龄增长而逐渐增加。有趣的是，这些自然衰老的细胞并未表现出糖尿病相关β细胞衰老中观察到的特征。β细胞衰老的这种异质性强调了需要研究区分生理性β细胞衰老与糖尿病诱导的加速衰老的机制。
1型糖尿病中β细胞的衰老
1型糖尿病（T1D）是一种自身免疫性代谢疾病，其特征是胰腺β细胞的破坏、去分化和功能障碍。虽然T1D历来被视为儿童或青少年期发病的疾病，但其发病率在老年人中不断增加，这可由成年起病与儿童起病T1D之间年龄相关的遗传、免疫和代谢异质性来解释。
自身反应性T细胞被认为是T1D的中心驱动因素并介导β细胞破坏。先前的主要假设是T细胞介导β细胞近乎完全的破坏。然而，在疾病发作前观察到β细胞功能障碍以及长期T1D患者中存在β细胞，促使研究人员重新关注T1D发病的β细胞内源性机制。越来越多的证据支持这样的观点：β细胞不是被动靶标，而是可以通过采取应激或免疫原性状态积极促进疾病的启动和进展，从而放大免疫识别和炎症反应，加速β细胞衰老。
胰腺β细胞维持高分泌和生物合成负荷，胰岛素转录本占β细胞mRNA库的很大一部分，对内质网（ER）蛋白质稳态提出了非凡的需求。T1D患者的胰岛显示ER应激标志物增加，表明ER稳态被破坏。非肥胖糖尿病（NOD）小鼠（T1D小鼠模型）的形态计量学研究显示在T1D发病前存在一致的ER改变，其特征是分泌颗粒减少和ER结构肿胀、碎片化。这些小鼠的胰岛也未能启动与年龄相关的经典应激反应基因（如Atf4）的增加，这与适应慢性ER应激的能力有限一致。同时，NOD小鼠显示Pdx1 mRNA水平和preproinsulin（Ins1/2）的进行性年龄依赖性降低。这些发现支持这样的概念：β细胞中慢性ER适应可导致转录景观的重塑，引起β细胞身份和功能的丧失。
未折叠蛋白反应（UPR）是一种ER蛋白质稳态监视通路，被激活以恢复ER稳态。UPR的早期适应性臂涉及PERK介导的真核翻译起始因子2α（eIF2α）磷酸化，其瞬时抑制全局翻译并减少新生蛋白流入ER。同时，ATF6和IRE1α调节转录程序，诱导ER应激反应元件（ERSEs）和其他UPR靶基因，从而扩大折叠能力并维持ER功能。然而，在长期应激下，UPR在β细胞中从促适应状态转变为促凋亡状态，促进向疾病状态的进展。
ER应激已被观察到先于T1D发病：ER功能障碍通过NF-κB信号传导触发T1D中的β细胞功能障碍和自身免疫。NF-κB激活在β细胞凋亡中发挥作用，因为抑制该转录因子可保护β细胞免受细胞因子诱导的凋亡。胰岛中的炎症微环境诱导细胞因子信号传导以及β细胞中主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类的表达。β细胞上的MHC I类表达是自身反应性T细胞反应的关键启动因素，导致多种促炎细胞因子的产生增加，从而驱动T1D进展。在多种促炎细胞因子中，白细胞介素-1β（IL-1β）激活大鼠β细胞中的核因子-κB（NF-κB），促进多种凋亡基因的表达。此外，干扰素α（IFNα）驱动MHC I类上调并加剧ER应激，在ER功能障碍、UPR信号传导和炎症之间形成正反馈循环。胰岛微环境中促炎细胞因子的增加在T1D中持续观察到，表明ER功能障碍和上述UPR能力下降是疾病病理学的核心组成部分。
在T1D中， prolonged应激后，一部分β细胞采用替代细胞命运，进入衰老状态而非经历细胞死亡。尽管控制这一转变的机制仍未完全明确，但多项研究暗示β细胞衰老参与T1D发病机制。β细胞衰老是异质性的，只有一小部分细胞显示疾病相关细胞衰老的标志和特征——DNA损伤、SA-β-Gal活性升高、抗凋亡Bcl-2家族蛋白的激活以及功能性衰老相关分泌表型（SASP）因子的分泌。在NOD小鼠和人类T1D胰岛中，据报道SASP因子（趋化因子、细胞因子和细胞外基质成分）的分泌加剧了自身免疫反应。衰老标志物（包括p21Cip1和p16Ink4a）在T1D模型的β细胞中被检测到，尽管它们在疾病进展中的独特功能作用仍不清楚。在人类T1D供体胰腺和暴露于DNA损伤的分离胰岛中观察到p21Cip1上调，而p16Ink4a保持不变。最引人注目的是，在NOD小鼠中靶向清除衰老β细胞可阻止免疫介导的β细胞破坏并预防T1D发病。有趣的是，最近的一项研究表明，在幼鼠中通过删除UPR基因诱导的早期应激诱导衰老可能具有保护作用，在NOD小鼠20周时增强β细胞存活。这种保护作用归因于M2巨噬细胞的募集，其促进早期衰老β细胞的清除并减少晚期衰老。
总之，这些发现表明T1D中的β细胞衰老反映了内在衰老过程和疾病加速的应激反应。慢性ER应激、受损的UPR适应和炎症汇聚在一起，促进β细胞身份的丧失、免疫原性增加以及衰老状态的出现，进一步加剧疾病进展。这一框架将衰老置于β细胞脆弱性的中心，即生理性衰老和自身免疫应激的交汇点。界定β细胞如何在适应性和非适应性衰老状态之间转换对于设计保护功能和限制疾病进展的策略至关重要。
2型糖尿病中β细胞的衰老
2型糖尿病（T2D）是一种复杂的代谢性疾病，其特征是血糖异常，由功能性β细胞群的进行性衰退引起，约占2021年全球糖尿病病例的96%。在健康个体中，胰腺β细胞具有显著的能力来补偿胰岛素抵抗状态下的胰岛素需求增加（例如在肥胖、青春期或怀孕期间），通过增加其功能β细胞群来实现。然而，在风险个体中，慢性代谢应激可压倒这种适应能力，导致β细胞失代偿和衰竭。
去分化是T2D中β细胞功能障碍的另一机制。去分化的β细胞失去其成熟身份并向祖细胞样状态逆转。T2D β细胞还显示与线粒体功能、糖酵解和β细胞身份相关的基因调控网络紊乱。
衰老参与T2D病理生理学的证据得到其在老年人中发病率显著增加的支持。衰老是T2D的主要风险因素，多个衰老标志促成加速的β细胞衰退。其中一个标志是蛋白质稳态受损，这是维持适当蛋白质折叠和质量控制的细胞过程。T2D中与胰岛素抵抗相关的慢性代谢需求对β细胞施加持续的生物合成负担以增加胰岛素生产，与T1D中观察到的免疫介导应激形成对比。这种升高的ER工作负荷促进错误折叠蛋白的积累，导致UPR的持续激活。随着时间的推移，这种反应可从适应性转变为非适应性，促成β细胞功能障碍，并在后期导致凋亡。
线粒体功能障碍是糖尿病β细胞中存在的另一经典衰老标志。正常的线粒体生物能量学对葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）至关重要。T2D β细胞显示线粒体形态扩张、嵴破坏和生物能量学降低。T2D β细胞的一项蛋白质组学研究确定了线粒体基质蛋白酶LONP1的表达降低，导致线粒体蛋白错误折叠和呼吸功能降低。此外，解偶联蛋白-2（UCP2）的上调（一种促进质子泄漏和解偶联线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）的内膜蛋白）负向调节β细胞中的GSIS。与对照组相比，T2D患者胰岛中UCP2 mRNA水平增加。与肥胖相关的代谢应激源，包括慢性高血糖和高脂肪酸，损害β细胞线粒体功能并增加活性氧（ROS）。这种氧化应激可促进UCP2诱导和/或激活，从而降低线粒体偶联效率并减弱葡萄糖刺激的胰岛素分泌，损害β细胞功能。
DNA损伤也促成T2D中的β细胞衰退。在T2D患者和糖尿病小鼠模型的胰岛中观察到DNA链断裂增加。β细胞中DNA修复基因Ercc1的缺失导致小鼠成年起病糖尿病，以进行性β细胞功能障碍为特征。在培养的小鼠β细胞中，阿霉素诱导的DNA损伤上调p21，诱导DNA损伤修复反应以防止凋亡。然而，诱导DNA损伤的信号的类型似乎决定p21的作用；当通过ER或氧化应激诱导时，p21促进而非抑制β细胞凋亡。
在慢性代谢应激下，β细胞并非统一经历细胞死亡；相反，一部分进入衰老状态。在小鼠中，胰岛素受体化学拮抗剂（S961）或高脂饮食（HFD）诱导的胰岛素抵抗加速衰老发作并增加β细胞中衰老标志物p21Cip1的表达，导致功能衰退和葡萄糖耐量受损。重要的是，允许在给予B/B同型二聚化剂时删除表达p16Ink4a的衰老β细胞的转基因小鼠模型显示，老年小鼠的葡萄糖代谢改善、胰岛素分泌增强以及胰岛中SASP基因表达降低，表明衰老细胞清除（senolysis）可作为T2D的预防策略。此外，β细胞衰老似乎具有高度的情境依赖性：在自然衰老中，衰老可能不发生DNA损伤或SASP激活，而在糖尿病中，自身免疫和代谢应激源驱动非适应性β细胞衰老，加速功能障碍。
除了两种常见形式的糖尿病，青少年发病的成人型糖尿病（MODY）是一种单基因糖尿病，由调节β细胞发育和功能的基因突变引起。在与MODY相关的基因中，转录因子MAFA在β细胞成熟和胰岛素分泌中起核心作用。Mafa错义突变（MAFA S64F突变小鼠）导致衰老β细胞的积累和功能障碍，表明细胞衰老是不同形式糖尿病的共同病理机制。有必要更深入地了解调节衰老从相对良性状态向病理状态转变的分子触发因素，跨越疾病亚型。
总之，这些发现强调β细胞衰老的标志是相互关联的过程，汇聚在一起驱动多种糖尿病形式中的β细胞功能障碍。虽然许多糖尿病相关的衰老标志与经典生理标志重叠（转录重编程、线粒体功能障碍和衰老），但驱动它们的机制不同。例如，生理性衰老缺乏SASP因子，这是疾病相关衰老的特征。此外，糖尿病相关衰老以慢性炎症和延长ER应激导致促凋亡信号为特征。
糖尿病中m6A调控β细胞衰老的展望
尽管衰老标志已在转录和蛋白质水平上跨疾病状态被广泛研究，但调节它们的表观转录组机制才刚刚开始被理解。最近的多项证据表明，m6A修饰调控β细胞生物学，表明表观转录组调控可能代表了许多这些衰老相关过程的上游控制层。
虽然m6A机制和功能的详细描述超出了本综述的范围，我们简要总结了 governing动态甲基化过程的m6A调节因子的三类：writer，将甲基基团沉积在靶腺苷核苷酸上；eraser，使m6A位点去甲基化；reader，在遇到m6A修饰的RNA时调节下游分子反应。
writer复合物，也称为甲基转移酶复合物（MTC），包含催化组分甲基转移酶样3（METTL3）和结构适配器METTL14。它还包括调节因子，如Wilms瘤1相关蛋白（WTAP）、vir样m6A甲基转移酶相关蛋白（VIRMA/KIAA1429）、锌指CCCH结构域包含蛋白13（ZC3H13）和RNA结合基序蛋白（RBM15/RBM15B）。这些蛋白共同介导靶mRNA上的m6A沉积。Eraser利用α-酮戊二酸作为底物、Fe(II)作为催化辅因子使m6A去甲基化。已知的eraser包括脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）和AlkB同源物5（ALKBH5）蛋白。Reader蛋白识别m6A修饰的转录本以确定mRNA的命运。Reader蛋白的例子包括YTH结构域包含1/2家族（YTHDC1/2）、YTH结构域家族（YTHDF1/2/3）、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白家族（IGF2BP1/2/3）和异质核核糖核蛋白C（HNRNPC）。尽管几项研究报道了YTHDF家族三个旁系同源物的不同功能——YTHDF1增强mRNA翻译，YTHDF2促进mRNA降解，YTHDF3介导翻译和降解——但最近的研究质疑了这一结论，并提出YTHDF蛋白冗余地调节mRNA命运。通过writer、eraser和reader的综合作用，m6A在生理和病理条件下塑造基因表达。
研究人员最近的工作表明，m6A甲基化的差异比mRNA丰度的差异更能有效地区分人类T2D胰岛与非糖尿病胰岛。研究人员还整合了已发表的β细胞scRNA-seq数据与m6A-seq数据集，以检查m6A标记的转录本在表达水平的行为。在鉴定为m6A修饰的转录本中，与非糖尿病供体相比，T2D β细胞的mRNA表达变异系数（转录噪声）更高，而对于非m6A转录本则未观察到这种增加。总之，这些发现支持一个模型，其中T2D相关的m6A缺失与转录微调受损相偶联。
来自T2D供体的人类胰岛显示，与非糖尿病对照相比，涉及β细胞生物学关键方面的转录本（包括功能和身份）出现低甲基化。在人类β细胞系（EndoC-βH1）中，敲低m6A writer METTL3或METTL14可重现这种低甲基化，导致β细胞功能障碍和受损的胰岛素受体/IGF1R信号传导。一致地，β细胞特异性Mettl14敲除小鼠（M14KO）显示年龄依赖性的β细胞身份丧失，成熟β细胞标志物（如Pdx1、Mafa和Ucn3）的表达降低。此外，Mettl14缺陷的β细胞显示明显的胰岛素脱颗粒，支持m6A在维持β细胞身份和功能中的直接作用。
m6A低甲基化似乎还参与β细胞的DNA损伤反应通路，为糖尿病中与衰老相关的标志提供了潜在联系。在EndoC-βH1细胞中，m6A水平降低诱导G0/G1细胞周期停滞并激活ATM依赖的DNA损伤反应。这一表型在M14KO模型中得到反映，其中磷酸化蛋白谱揭示与对照相比，胰岛中DNA损伤相关通路的富集。
扩展这些观察结果，m6A还在T1D中调节β细胞先天免疫反应。在T1D发病时，m6A writer METTL3的增加促进m6A甲基化，使先天免疫介质（包括2'-5'-寡腺苷酸合成酶（OAS）和作用于RNA的腺苷脱氨酶1（ADAR1））不稳定，从而在疾病发作时控制其增加的幅度。这一过程可能是由发病前观察到的细胞内活性氧（ROS）增加触发的。ROS升高导致DNA、蛋白质和脂质的氧化损伤，促成已知的衰老标志：ER应激、线粒体功能障碍和受损的蛋白质稳态。氧化还原失衡成为β细胞中m6A writer的关键调节因子，因为ROS的积累损害METTL3酶活性，表明m6A可能介导对氧化应激的下游细胞反应。
虽然初步发现令人鼓舞，但衰老背景下m6A的研究仍相对新兴，m6A重塑与衰老标志之间的因果关系仍有待确立。继续努力界定m6A如何调节β细胞中的衰老程序可能揭示糖尿病发病机制的新机制联系，并发现治疗机会。一个关键未解决的问题是，生理性β细胞衰老期间出现的m6A图谱是否与糖尿病中观察到的图谱相似，还是代表独特的疾病相关状态。单细胞和细胞类型分辨的表观转录组分析对于确定衰老相关的m6A重塑是否均匀发生在胰岛内分泌群体中或遵循细胞类型特异性轨迹非常重要。
未来的工作还应通过建立方向性来测试m6A失调是否是典型β细胞衰老机制（包括DNA损伤、线粒体功能障碍/生物发生缺陷和衰老）的上游驱动因素或下游后果。其他途径包括界定m6A与其他衰老标志（如氧化还原失衡和蛋白质毒性应激）之间的串扰。最后，鉴定与m6A writer复合物相互作用的RNA结合蛋白和衔接因子，以及它们是否在衰老中富集或被选择性招募，将是有益的。此类研究可能允许对m6A进行上下文特异性靶向，作用于不同的转录网络。总之，这些方法可能使正常化m6A依赖的RNA调节和维持衰老及糖尿病中功能性β细胞群的策略成为可能。
