装载SSK1的脱细胞纤维环基质-聚乙二醇二丙烯酸酯水凝胶通过调控NF-κB信号通路和铁死亡缓解椎间盘退变

《Journal of Orthopaedic Translation》：An SSK1-loaded decellularized annulus fibrosus matrix-based PD hydrogel alleviates intervertebral disc degeneration through modulation of NF-κB signaling and ferroptosis

　　

研究人员旨在阐明SSK1的治疗效应及其潜在机制，并开发一种可注射的SSK1负载水凝胶以实现椎间盘退变（IDD）的局部持续治疗。研究人员建立了白细胞介素-1β（IL-1β）诱导的髓核细胞（NPCs）退变模型，以评估胞外基质（ECM）代谢、铁死亡、细胞衰老及炎症信号。研究人员进行了铁死亡相关拯救实验、NF-κB和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的药理学调控，以及PPARγ敲低实验以探究潜在机制。SSK1被掺入聚乙二醇二丙烯酸酯/脱细胞纤维环基质水凝胶（SSK1@PD）中。研究人员在体外和针刺诱导的大鼠IDD模型中，通过影像学、组织学、免疫组织化学和生化分析评估了SSK1@PD的物理化学性质、细胞相容性、缓释行为和治疗效果。结果表明，SSK1显著减轻了IL-1β诱导的NPCs退行性改变，包括ECM降解、铁积累、脂质过氧化、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）丢失和细胞衰老。机制上，SSK1恢复了PPARγ表达并抑制了NF-κB激活。PPARγ沉默在很大程度上消除了SSK1的保护作用，而PPARγ的药理学激活则部分重现了这些作用。SSK1@PD水凝胶表现出良好的物理化学性质、良好的细胞相容性和持续的药物释放。在体内，SSK1@PD的局部注射保留了椎间盘高度和组织学结构，改善了ECM稳态，并减少了退变椎盘中与铁死亡、衰老和NF-κB相关的改变。研究结论为，SSK1@PD通过实现SSK1的持续局部递送并调控退行性细胞反应，至少部分通过PPARγ/NF-κB/铁死亡轴，缓解了IDD。这种可注射的生物材料平台代表了一种有前景的IDD微创治疗策略。

## 研究背景与科学问题

下腰痛（LBP）是全球范围内导致残疾的主要原因之一，给现代医疗系统带来重大社会经济负担，而椎间盘退变（IDD）是慢性及复发性下腰痛的主要病理基础。IDD的特征是细胞外基质（ECM）进行性分解、椎间盘脱水、结构紊乱以及髓核细胞（NPCs）功能障碍，最终导致机械不稳定性和慢性疼痛。目前IDD的临床治疗主要局限于症状缓解，包括镇痛药物、康复训练和外科手术干预，而非对退变椎间盘进行生物学修复。因此，开发能够阻止或逆转椎间盘退变的疾病修饰策略仍是亟待满足的临床需求。

越来越多的证据表明，IDD并非单纯的被动磨损过程，而是涉及炎症激活、氧化应激、细胞命运调控异常和基质分解代谢的复杂病理级联反应。特别是，促炎介质如白细胞介素-1β（IL-1β）的持续刺激会破坏NPCs的合成分解平衡，加速衰老相关表型，并放大椎间盘微环境的退变重塑。除凋亡和坏死性凋亡外，铁死亡——一种以脂质过氧化和氧化还原崩溃为特征的、铁依赖性的调控性细胞死亡形式——最近已成为包括IDD在内的退行性疾病的关键驱动因素。NPCs中的铁死亡性损伤与铁超载、谷胱甘肽（GSH）耗竭、GPX4失活以及脂质过氧化物过度积累密切相关，这些因素共同加剧基质降解和椎间盘功能障碍。值得注意的是，NF-κB等炎症通路与铁死亡相关的细胞损伤深度交织，提示同时调控炎症信号和铁死亡应激可能为IDD提供机制上强有力的治疗途径。

SSK1是一种半乳糖修饰的前药，先前被开发用于选择性靶向衰老相关细胞，已在抑制慢性炎症和改善年龄相关组织功能障碍方面显示出广泛的生物学活性。然而，SSK1能否保护NPCs免于退变相关的铁死亡性损伤，以及此类效应在机制上是否与NF-κB信号通路相关，尚属未知。此外，椎间盘致密无血管的结构极大地限制了全身给药的可及性，使得局部持续递送成为实现有意义治疗效果的必要条件。

## 研究设计与主要结论

基于上述考量，研究人员提出假设：SSK1可通过调控PPARγ/NF-κB/铁死亡轴缓解IDD相关细胞损伤，且将其整合入PEGDA/DAFM基础水凝胶可实现持续局部递送并增强治疗效果。为验证该假设，研究人员开发了SSK1负载的PEGDA/DAFM水凝胶（SSK1@PD）作为可注射的局部治疗平台，系统研究了SSK1缓解IL-1β诱导的NPC退变损伤的能力，探索其保护效应是否与PPARγ/NF-κB/铁死亡轴的调控相关，并对水凝胶的结构、物理化学和生物学性质进行了系统表征，最终在IDD大鼠模型中评估了SSK1@PD的治疗功效。

该研究于《Journal of Orthopaedic Translation》发表，通过整合机制引导的药理学干预与组织特异性生物材料工程，建立了椎间盘退变的局部治疗策略，为生物材料赋能的IDD治疗提供了有前景的转化框架。

## 关键技术方法

研究人员采用了多物种来源的NPCs：人NPCs来源于因创伤性脊髓损伤行脊柱手术患者的椎间盘组织（年龄18-60岁），另从大鼠和小鼠尾椎间盘分离NPCs用于跨物种细胞活性分析。体外实验以IL-1β（10 ng/mL）刺激24小时建立退变损伤模型。机制研究采用铁死亡抑制剂Fer-1和激活剂erastin、NF-κB抑制剂NF-κB-IN-1和激活剂PMA，以及PPARγ激动剂吡格列酮；PPARγ敲低通过shRNA转染实现。分子检测包括RT-qPCR、蛋白质印迹、免疫荧光、SA-β-半乳糖苷酶染色、BODIPY 581/591 C11脂质过氧化检测、以及MDA、Fe²⁺、总铁和GSH含量测定。RNA测序在Illumina NovaSeq 6000平台进行，后续进行GO和KEGG富集分析。

水凝胶制备方面，大鼠尾纤维环组织经胰蛋白酶、核酸酶和Triton X-100序贯处理获得脱细胞纤维环基质（DAFM），经胃蛋白酶消化后与PEGDA及光引发剂混合，405 nm蓝光交联形成PD水凝胶；SSK1在前体溶液中终浓度为5 μM。体内实验采用8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠针刺诱导IDD模型，分组为Sham、IDD、PD、游离SSK1和SSK1@PD组（每组n=6），术后1个月和2个月取材，进行X线、组织学、免疫组化、免疫荧光和生化分析。

## 研究结果

### IL-1β诱导NPCs发生铁死亡、衰老及退变相关改变

研究人员首先证实IL-1β以剂量和时间依赖性方式显著改变NPCs的基因表达谱：铁死亡相关基因ACSL4和TF上调，而抗氧化及铁死亡保护基因GPX4、SLC3A2和SLC7A11下调；衰老相关基因P53、P21、P16和LaminB1显著失调，伴炎性细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β和IL-18强烈诱导。蛋白水平上，IL-1β降低COL2和GPX4表达，升高MMP13、铁转运蛋白TF及衰老蛋白P53、P21。铁死亡抑制剂Fer-1较凋亡或坏死性凋亡抑制剂更有效地恢复COL2表达并降低MMP13表达，且IL-1β增加MDA、Fe²⁺和总铁水平、降低GSH含量，证实铁死亡参与IL-1β诱导的NPC退变。

### SSK1对衰老相关NPCs具有保守的跨物种效应并减轻凋亡和退变表型

SSK1对正常NPCs活性影响甚微，但对IL-1β、H₂O₂、依托泊苷或复制诱导衰老的人、大鼠和小鼠NPCs均显示选择性杀伤作用，其中依托泊苷诱导的人NPCs最为敏感。SSK1以浓度依赖性方式恢复IL-1β抑制的增殖相关基因（PCNA、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CyclinA1、CyclinB1、CyclinD1、CyclinE1）表达，恢复ECM合成标志物ACAN、COL2、SOX9并抑制分解标志物MMP13和ADAMTS5。EdU染色显示SSK1恢复NPC增殖能力，TUNEL显示其减轻IL-1β诱导的凋亡。

### SSK1减轻IL-1β诱导的ECM降解、铁死亡和衰老

SSK1恢复IL-1β处理NPCs中COL2和GPX4的mRNA及蛋白表达，降低MMP13、TF、P53和P21水平。生化检测显示SSK1减少MDA、Fe²⁺和总铁积累，恢复GSH水平。免疫荧光证实SSK1恢复COL2和GPX4荧光强度、降低MMP13 staining，SA-β-半乳糖苷酶染色显示SSK1显著减少衰老阳性细胞比例。

### SSK1的保护效应与铁死亡抑制相关

拯救实验显示，铁死亡抑制剂Fer-1与SSK1类似地恢复COL2和GPX4、抑制MMP13、TF、P53和P21，而铁死亡激活剂erastin largely abolished SSK1的保护作用。生化指标和GPX4免疫荧光均证实erastin削弱SSK1对铁死亡的抑制效应。

### SSK1抑制NF-κB激活并缓解铁死亡相关损伤

RNA测序火山图显示GPX4、p53、Col2a1和Mmp13等差异表达基因，GO和KEGG富集分析突出氧化应激、ECM组织、铁死亡、细胞衰老和NF-κB通路等。蛋白水平上，IL-1β增加p-IκBα/IκBα和p-P65/P65比值指示NF-κB robust激活，SSK1显著抑制这些改变，与NF-κB抑制剂效果相当，而NF-κB激活剂PMA largely reversed SSK1的抑制作用。SSK1和NF-κB抑制剂均逆转IL-1β诱导的MDA、Fe²⁺和总铁升高及GSH降低，PMA则削弱SSK1的保护效应，支持NF-κB激活与铁死亡损伤的机制关联。

### PPARγ介导SSK1的保护效应

RNA-seq分析提示PPARγ为SSAR1保护效应的潜在介导者。IL-1β降低PPARγ表达、增加p-IκBα/IκBα和p-P65/P65比值，SSK1恢复PPARγ并抑制NF-κB激活，而PPARγ敲低削弱这些效应，PPARγ激动剂吡格列酮部分重现之。PPARγ沉默显著减弱SSK1对COL2、MMP13、GPX4的调控及脂质过氧化的抑制作用，吡格列酮部分模拟SSK1的作用，证实PPARγ是SSK1保护效应的关键介导者，SSK1至少部分通过PPARγ/NF-κB/铁死亡轴缓解IL-1β诱导的NPC损伤。

### PD水凝胶的表征及其体外保护效应

DAFM有效去除细胞成分和核残留，DNA含量显著降低，胶原蛋白含量基本保留，部分GAG丢失。扫描电镜显示DAFM和PD水凝胶均具多孔结构。PD水凝胶具有缓释能力、适宜的溶胀和降解特性及压缩力学性能。活死染色显示DAFM和PD均无显著细胞毒性。DAFM和PD均部分逆转IL-1β诱导的COL2和GPX4降低及MMP13、TF升高，PD对ECM和铁死亡标志物的改善作用更强，但对P53和P21的作用相对有限。

### SSK1@PD进一步增强对退变、铁死亡和衰老的缓解作用

与PD相比，SSK1@PD更有效地恢复COL2和GPX4、抑制MMP13、TF、P53和P21的mRNA及蛋白表达；更有效地降低MDA、Fe²⁺和总铁、恢复GSH；免疫荧光显示SSK1@PD更好地恢复COL2和GPX4、抑制MMP13；SA-β-半乳糖苷酶染色显示SSK1@PD更显著减少衰老细胞比例，表明SSK1负载增强水凝胶的抗退变、抗铁死亡和抗衰老效应。

### SSK1@PD体内改善IDD并抑制铁死亡和衰老相关信号

在针刺诱导的大鼠IDD模型中，X线显示SSK1@PD更好地保留椎间盘高度，定量DHI分析证实其保护效应优于PD或游离SSK1。H&E和番红O/快绿染色显示SSK1@PD更有效保留椎间盘结构和基质丰富形态，组织学评分显著改善。免疫组化显示SSK1@PD恢复COL2、抑制MMP13，恢复GPX4、抑制P53，免疫荧光显示其减少p-P65表达。生化检测显示SSK1@PD更显著降低退变组织中的亚铁和MDA水平。

## 讨论总结

研究人员指出，IDD是以ECM紊乱、炎症放大、氧化应激失衡和细胞稳态丧失为特征的多因素进行性病变，目前治疗仍主要局限于对症处理。本研究开发的SSK1@PD水凝胶在机制层面和递送层面均产生双重获益：机制上，SSK1至少部分通过调控PPARγ/NF-κB/铁死亡轴缓解IL-1β诱导的NPC损伤并减轻衰老相关恶化；生物材料层面，PD水凝胶作为局部递送平台有助于SSK1在椎间盘内驻留并延长治疗作用。

研究人员强调铁死亡应被解读为退变网络的重要组成部分而非孤立终点，炎症应激削弱抗氧化防御并增加脂质过氧化易感性，而铁死亡性损伤进一步加剧基质分解代谢和细胞功能障碍。SSK1的保护效应通过Fer-1的拯救作用和erastin的拮抗作用证实与铁死亡抑制功能相关。PPARγ作为保护性转录调节因子，其沉默削弱SSK1效应而吡格列酮部分重现之，提示PPARγ恢复有助于NF-κB抑制和铁死亡抑制，但吡格列酮的部分效应提示可能存在其他机制。

研究人员还讨论了SSK1的衰老清除（senolytic）效应与细胞保护效应的生物学互补性：选择性清除功能失调的衰老NPCs可减少局部微环境中的炎症和分解应激，从而改善残留细胞的功能状态。SSK1优先消除衰老相关NPCs同时基本不损伤非衰老细胞，而存活细胞群体显示出改善的增殖、ECM稳态和抵抗铁死亡相关损伤的能力。整体保护效应可能涉及选择性清除功能失调衰老细胞和缓解残留NPCs退变应激的双重作用，但其抗铁死亡作用是直接效应还是继发于衰老清除活性尚需进一步研究。

此外，研究人员承认研究存在局限性：SSK1恢复PPARγ的精确分子基础尚待阐明；大鼠尾椎间盘模型无法完全重现人腰椎间盘退变的尺寸、生物力学和慢性进展；体内实验观察期相对较短，长期效应和材料重塑有待评估；SSK1剂量和水凝胶配方有待优化，体内释放动力学和降解行为需全面表征，重复给药的长期安全性以及影像引导微创椎间盘内注射的可行性有待评价。

## 研究结论

研究人员开发了一种可注射的SSK1负载PEGDA/DAFM水凝胶，其通过调控PPARγ/NF-κB/铁死亡轴和改善局部椎间盘微环境，有效缓解椎间盘退变。该平台结合了良好的物理化学和生物力学性质、优异的细胞相容性和缓释能力，在体外和体内均表现出稳健的抗衰老、抗铁死亡和抗衰老效应。研究结论为机制引导的、基于基质材料的IDD局部治疗提供了强有力的临床前依据，并支持对SSK1@PD用于退行性椎间盘疾病的进一步转化评估。