叶酸缓解X射线辐照诱导的斑马鱼颌面畸形

《Congenital Anomalies》：Folic Acid Alleviates X-Ray Irradiation-Induced Jaw Malformation in Zebrafish

　　

X射线（X-ray, XR）是一种电离辐射，具有足够的能量从原子中移除电子，从而产生潜在有害的离子。在器官发生期间进行X射线辐照可产生深远的损害效应，其严重程度取决于发育阶段和辐照能量。在本研究中，研究人员检测了X射线辐照对受精后36小时（36 hpf）斑马鱼发育的影响，观察到明显的颌面畸形，而叶酸（Folic Acid, FA）预处理可缓解该畸形。机制研究表明，叶酸预处理抑制了辐照诱导的活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）产生。在辐照后24小时和48小时进行的转录组分析显示，载脂蛋白A-IV a（apolipoprotein A-IV a, apoa4a）、蛋氨酸腺苷转移酶1A（methionine adenosyltransferase 1A, mat1a）、热休克蛋白90α类A成员1串联重复1（heat shock protein 90 alpha class A member 1 tandem duplicate 1, hsp90aa1.1）、FKBP脯氨酰异构酶5（FKBP prolyl isomerase 5, fkbp5）、plac8 onzin相关蛋白3（plac8 onzin related protein 3, ponzr3）和前列腺素E合酶3a（prostaglandin E synthase 3a, ptges3a）的表达发生紊乱，而在辐照前经叶酸处理的斑马鱼中未观察到这一现象。这些发现提示，叶酸至少可通过降低氧化应激和改善紊乱的基因表达来缓解X射线辐照诱导的斑马鱼颌面畸形。

颅面畸形是与头颈部软组织与骨组织发育和分化相关的缺陷，通常源于早期胚胎发生的一个或多个阶段的紊乱。人类最常见的颅面缺陷包括腭裂、唇裂和口面裂，其中唇裂和/或腭裂的发生率约为每700例活产1例。其他常见缺陷包括半侧颜面短小症、颅缝早闭和前脑无裂畸形。这些缺陷通常与神经嵴细胞（Neural Crest Cell, NCC）发育的调控异常相关，特别是细胞形成、迁移或分化的损伤。颅面畸形的病因多样，已明确的包括基因突变、酒精、 acting、叶酸缺乏、感染、妊娠期糖尿病、药物以及电离辐射等环境致畸因子。

X射线作为最常见的电离辐射形式，在医学领域有广泛应用，包括诊断技术和放射治疗。然而，在胚胎发生的早期阶段暴露于X射线可导致发育缺陷，这主要是由于快速分化细胞中产生活性氧、氧化应激和DNA损伤所致。鉴于人类器官发生的关键期发生在妊娠3-8周，而许多女性在此时期尚未意识到妊娠，因此亟需识别能够防护X射线诱导的发育异常的策略。

叶酸是一种必需的水溶性B族维生素，是广泛推荐用于预防胎儿神经管缺陷的妊娠期补充剂。叶酸在一碳代谢中发挥关键作用，该过程涉及甲基和甲酰基等单碳单位在DNA合成和修复等关键过程中的转移。此外，叶酸具有抗氧化特性，可作为有害自由基的保护剂，减少电离辐射暴露导致的氧化损伤。然而，叶酸补充是否能够防护辐射诱导的发育损伤，特别是颅面发育方面，尚未完全阐明。

为探讨这一问题，研究人员以斑马鱼为模型，检测了X射线辐照对颌面发育的影响，并研究了叶酸预处理对X射线诱导缺陷的作用。斑马鱼具有光学透明的特性，可精确时空监测蛋白表达和基因表达等关键事件，且其调控颅面形态发生的分子通路与高等脊椎动物高度保守，是评估环境因素及治疗/保护性干预对这些过程影响的理想模型。基于此，研究人员还评估了X射线诱导效应的潜在机制。

该研究使用白化斑马鱼品系slc45a2^b4/b4，该品系缺乏黑素细胞中的黑色素色素沉着。胚胎通过自然交配获得，在0.3× Danieau溶液中于28.5℃±0.5℃、14小时/10小时光暗周期条件下培养。

实验设置三个组进行成像分析（对照组、X射线辐照组、叶酸+X射线辐照组）和四个组进行转录组分析（对照组、X射线辐照组、叶酸组、叶酸+X射线辐照组）。在35或35.5 hpf时，向叶酸组和叶酸+X射线辐照组加入 freshly prepared sterile solution of 叶酸，终浓度为200 μM（转录组分析）或400 μM（成像分析）；对照组和X射线辐照组加入等体积0.3× Danieau溶液。预孵育0.5或1小时后，X射线辐照组和叶酸+X射线辐照组置于X射线辐照装置中（管电压150 kV，管电流20 mA），接受8 Gy X射线辐照，约需5分钟。随后各组胚胎在含或不含叶酸的0.3% Danieau溶液中继续培养，直至37 hpf和120 hpf（分别为辐照后1小时和84小时）进行成像分析，或37、60、84 hpf（分别为辐照后1、24、48小时）进行转录组分析。

研究主要关键技术方法包括：Alcian蓝染色结合ImageJ软件进行颅面形态测量分析，量化Meckel软骨长度和ceratohyal角度；2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCF-DA）荧光染色结合Olympus SZX10荧光体视显微镜检测头部活性氧水平；以及RNA测序（RNA-Seq）转录组分析，使用HiSeq X Ten系统进行150 bp双端测序，TCC包进行差异表达基因分析，g:Profiler进行基因本体分析，转录组数据已提交GEO数据库（登录号GSE334519）。

**X射线辐照诱导的颌面畸形经叶酸预处理缓解**

为评估X射线辐照和叶酸预处理对颌面发育的影响，研究人员设立三个实验组：对照组、36 hpf X射线辐照组、以及35 hpf叶酸（400 μM）处理后续36 hpf X射线辐照组。胚胎培养至120 hpf后进行Alcian蓝染色和成像分析。对照组胚胎显示正常发育的Meckel软骨和ceratohyal软骨，Meckel软骨尖端位于眼尖的吻侧，ceratohyal软骨尖端内角小于180°。相反，X射线辐照组胚胎表现出Meckel软骨超出眼尖的突出受损，ceratohyal软骨内角增大。而叶酸预处理1小时后X射线辐照的胚胎，其Meckel软骨突出和ceratohyal软骨角度与对照组相似。定量分析证实，X射线组Meckel软骨尖端至双眼尖端连线的垂直距离显著缩短，ceratohyal软骨内角显著增大；而叶酸+X射线组上述参数与对照组无显著差异。200 μM叶酸亦表现出保护趋势。该结果表明，36 hpf X射线辐照导致斑马鱼颌面畸形，而叶酸预处理可缓解该畸形。

**X射线辐照诱导的活性氧形成经叶酸预处理抑制**

鉴于氧化损伤参与电离辐射诱导的胚胎发育缺陷，且叶酸是活性氧清除剂，研究人员检测了X射线辐照联合或不联合叶酸预处理对斑马鱼胚胎活性氧产生的影响。35.5 hpf时，叶酸+X射线组加入400 μM叶酸，所有三组均加入DCF-DA。36 hpf进行X射线辐照，37 hpf进行荧光显微镜分析。代表性图像显示，X射线暴露组斑马鱼荧光信号较对照组显著增强，而叶酸预处理组未观察到该增强效应。头部荧光信号定量分析证实，X射线辐照显著增加荧光信号，而叶酸预处理使其恢复至对照组水平。200 μM叶酸亦表现出抑制活性氧产生的趋势。该结果提示，X射线辐照增加斑马鱼头部活性氧产生，而叶酸预处理可对抗该效应。

**转录组分析鉴定X射线辐照诱导且经叶酸预处理恢复的差异表达基因**

为深入探究X射线诱导颌面畸形及叶酸保护的分子机制，研究人员对对照组、X射线组、叶酸组和叶酸+X射线组进行转录组分析。转录组分析使用200 μM而非400 μM叶酸，以检测叶酸的初级靶基因。分析时间点设为37 hpf（辐照后1小时）、60 hpf（辐照后24小时）和84 hpf（辐照后48小时）。

37 hpf的转录组分析旨在检测X射线和/或叶酸对基因表达的早期效应。该分析鉴定出25个和77个分别在X射线组vs对照组、X射线组vs叶酸组差异表达的基因，但X射线组vs叶酸+X射线组未鉴定出差异表达基因，提示辐照后1小时内叶酸预处理可能尚不足以影响基因表达。叶酸组与对照组之间无差异表达基因。25个和77个基因中共有17个基因重叠，基因本体分析显示这些基因富集于肿瘤蛋白p53（tumor protein p53）靶基因，包括v-fos FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物Ab（fosab）、生长停滞和DNA损伤诱导α a（growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha, a, gadd45aa）、干扰素刺激外切酶基因20（interferon stimulated exonuclease gene 20, isg20）、MDM2原癌基因（MDM2 proto-oncogene, mdm2）、pleckstrin同源样结构域A家族成员3（pleckstrin homology-like domain, family A, member 3, phlda3）、磷脂酰肌醇-3-激酶调控亚基3a（phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3a, pik3r3a）和核糖体蛋白S27（ribosomal protein S27, rps27）。这些基因在四组胚胎中的表达确认叶酸预处理不影响辐照后1小时的基因表达变化。该结果提示，肿瘤蛋白p53靶基因表达在X射线辐照后1小时内增加，但不受叶酸预处理影响。

随后，研究人员检测辐照后较晚时间点的基因表达。60 hpf（24 hpi）和84 hpf（48 hpi）时，X射线组vs对照组分别有211个和469个差异表达基因；X射线组vs叶酸组分别有456个和169个差异表达基因；X射线组vs叶酸+X射线组分别有5个和8个差异表达基因。60 hpf时，载脂蛋白A-IV a（apoa4a）和热休克蛋白90α类A成员1串联重复1（hsp90aa1.1）为三个比较组中的共有基因。84 hpf时，FKBP脯氨酰异构酶5（fkbp5）、蛋氨酸腺苷转移酶1A（mat1a）、plac8 onzin相关蛋白3（ponzr3）和前列腺素E合酶3a（ptges3a）为三个比较组中的共有基因。这六个基因的基因本体分析显示显著富集于蛋白折叠相关基因，包括hsp90aa1.1、fkbp5和ptges3a。

在讨论部分，研究人员指出，36 hpf是神经嵴迁移和软骨形成的关键期，该时间点X射线辐照导致Meckel软骨长度显著缩短和ceratohyal软骨角度增大，这些表型可能源于软骨细胞生长、基质沉积和/或空间组织的损伤。叶酸预处理可部分或完全预防上述缺陷。DCF-DA染色分析显示，叶酸预处理降低X射线辐照后的荧光信号，表明叶酸可减少氧化应激负荷。这些发现与既往研究一致，证实叶酸对斑马鱼妊娠期化学和环境应激原具有保护作用，例如叶酸可减轻砷暴露引起的氧化损伤和发育毒性，以及缓解双酚A诱导的神经毒性和氧化应激。叶酸可通过直接清除活性氧和抑制NADPH氧化酶介导的活性氧产生等多种机制抑制活性氧。

转录组分析进一步揭示了叶酸保护作用的分子机制。X射线辐照增加了肿瘤蛋白p53靶基因的表达，这与既往显示X射线可激活肿瘤蛋白p53及其靶基因转录的研究一致。肿瘤蛋白p53激活抗氧化基因（如谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶）可能具有益处，但在高氧化应激条件下诱导促氧化基因（如肿瘤蛋白p53诱导基因3和脯氨酸氧化酶）则可能有害。叶酸预处理抑制活性氧产生的结果提示，X射线诱导的肿瘤蛋白p53激活在斑马鱼发育过程中至少具有部分益处。值得注意的是，叶酸预处理不影响辐照后1小时的基因表达变化，这可能因为叶酸调节肿瘤蛋白p53在氧化还原稳态中的功能而不影响其转录活性。

24小时和48小时转录组分析鉴定出与蛋白折叠相关的多个基因的紊乱表达，包括hsp90aa1.1、fkbp5和ptges3a，叶酸预处理减轻了辐照对多个基因表达的影响。这与既往显示X射线辐照破坏蛋白折叠、叶酸治疗恢复蛋白折叠的研究一致。氧化应激可导致内质网应激并加剧蛋白错误折叠。

叶酸还恢复了X射线辐照后24小时apoa4a表达下调和48小时mat1a表达下调。Apoa4在脂质转运中发挥重要作用，亦具有抗氧化和抗炎特性。在小鼠四氯化碳诱导的急性肝损伤模型中，Apoa4过表达可减轻氧化损伤和炎症，而Apoa4缺乏则加重组织损伤。Apoa4还可通过调节细胞内谷胱甘肽氧化还原平衡减轻氧化剂诱导的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡。叶酸补充可延缓载脂蛋白E缺乏小鼠的动脉粥样硬化病变发展，可能通过增加Apoa4表达实现。Mat1a编码负责腺苷基团转移的酶，参与S-腺苷甲硫氨酸形成，后者在DNA和蛋白合成等许多细胞过程中发挥关键作用。Mat1a功能损伤导致S-腺苷甲硫氨酸产生减少，进而引起谷胱甘肽合成降低、线粒体功能障碍和氧化应激。Mat1a损伤还导致DNA和组蛋白等生物甲基化过程的调控异常，而这对基因表达调控至关重要。

综上所述，该研究表明X射线辐照增加氧化应激，并紊乱与蛋白折叠和生物甲基化相关的基因表达，而叶酸预处理可缓解这些效应。这些结果拓展了哺乳动物模型中的既往观察，为探索叶酸作为安全且经济有效的辐射防护剂提供了机制基础，对高等脊椎动物包括人类的产前氧化应激防护具有潜在意义。该研究发表于《Congenital Anomalies》。