基于碱基编辑（base editing）技术构建的人WDR34与WDR60疾病等位基因模型重现逆向鞭毛内运输（IFT）及Hedgehog信号传导缺陷

《Communications Biology》：Base editing-derived models of human WDR34 and WDR60 disease alleles replicate retrograde intraflagellar transport (IFT) and hedgehog signaling defects

　　

细胞质动力蛋白-2（cytoplasmic Dynein-2）/鞭毛内运输动力蛋白（IFT-dynein）是已知的唯一逆向鞭毛内运输（IFT）马达。两种动力蛋白中间链WDR34和WDR60功能障碍可导致短肋胸廓发育不良（SRTD），这是一种致死率较高的人类骨骼软骨发育异常。然而，单个蛋白的功能尚未充分阐明，因为WDR34或WDR60的完全功能丧失在脊椎动物中是致死的，且SRTD患者至少携带一个推定的低形态（hypomorphic）错义等位基因。因此，基因敲除模型不适合用于研究这些人类错义疾病等位基因的效应。利用CRISPR单碱基编辑器，研究人员重建了三种不同的人类疾病错义等位基因，其中包括本研究发现的一种新型WDR60变异p.Ala₉₆₈Val。与既往dynein-2完全功能丧失模型及患者成纤维细胞中的研究结果一致，突变细胞系表现出Hedgehog信号传导缺陷及逆向IFT紊乱。转录组分析显示，与多种生物学过程相关的基因表达存在差异调控，其中包括肌动蛋白细胞骨架（actin cytoskeleton）的调控。进一步地，研究人员观察到与高尔基体（Golgi）细胞内运输相关基因的差异化调控。除提供可用于研究人类SRTD疾病等位基因效应的细胞模型系统外，研究结果还提示，WDR34和WDR60除作为纤毛逆向IFT马达复合物的组分外，还具有非纤毛功能。

该论文发表于《Communications Biology》。

研究背景：纤毛是细胞感知外界信号的天线样细胞器，鞭毛内运输（IFT）负责将纤毛内外的货物有序运输。细胞质动力蛋白-2（dynein-2），又称IFT-dynein，是目前已知的唯一负责将货物从纤毛顶端运回基部的逆向IFT马达。该复合物由重链DYNC2H1、中间链WDR34与WDR60、轻中间链DYNC2LI1及轻链等亚基组成。dynein-2功能障碍可导致短肋胸廓发育不良（SRTD），患者表现为胸廓狭窄、肋骨和长骨短小、肺发育不良及多指/趾等骨骼软骨发育异常，严重者在围产期因心肺衰竭死亡。既往全基因敲除模型显示，Dync2h1、Wdr34或Wdr60完全缺失可致小鼠中胚期致死并在体外造成严重纤毛生成缺陷，无法真实模拟临床上患者通常至少携带一个低形态错义等位基因的遗传特点。因此，保留蛋白部分功能的等位基因特异性模型对于研究人类错义突变的致病机制并避免纤毛截断带来的继发性效应至关重要。

研究人员开展的研究、主要结论与意义：为克服全基因敲除模型的局限，研究人员采用CRISPR单碱基编辑技术在Cilia-APEX-IMCD3细胞中构建了携带三种人类SRTD错义等位基因的纯合细胞模型，并系统评估了逆向IFT、Hedgehog信号传导、全转录组变化及高尔基体功能。研究不仅证实并扩展了dynein-2中间链突变可造成逆向IFT和Hedgehog信号缺陷的认识，还揭示了WDR34与WDR60可能具有纤毛外的功能，提示COPI-高尔基体运输障碍可能参与SRTD骨骼表型的发病机制，为患者来源等位基因功能研究提供了新的体外模型。

主要方法概述：本研究对一例来自土耳其近亲婚配家系、表现为典型SRTD的先证者SI_36行全外显子测序与Sanger验证；在Cilia-APEX-IMCD3小鼠内髓集合管细胞中利用BE4-Gam胞嘧啶碱基编辑器进行CRISPR碱基编辑，以纯合子方式重建人类疾病等位基因；随后通过免疫荧光检测IFT88顶端蓄积、纤毛长度与成纤毛率评估逆向IFT，Western blot分析SAG（Hedgehog激动剂）处理前后GLI3全长与抑制型片段比值以评估Hedgehog通路；对纤毛化和非纤毛化细胞行bulk RNA测序及基因本体（GO）富集分析；并以莫能菌素（monensin）诱导高尔基体应激，结合β-COP免疫荧光检测高尔基体恢复能力，随后通过野生型WDR34或WDR60质粒过表达进行挽救实验。

研究结果

新WDR60致病变异的鉴定：对先证者SI_36的全外显子测序及家系Sanger分析发现，其携带WDR60 c.2903C>T、p.Ala₉₆₈Val纯合错义变异，位于WD结构域，按常染色体隐性方式分离；MutationTaster和PolyPhen-2均预测该变异致病，且在gnomAD中未见报道。

利用CRISPR碱基编辑重现人类WDR34和WDR60错义等位基因：研究人员在Cilia-APEX-IMCD3细胞中分别纯合重建了小鼠Wdr34 p.Arg₁₈₃Trp、p.Gly₃₉₄Ser及Wdr60 p.Ala₉₁₁Val等位基因；编辑效率为0.66%–13%，其中WDR60 p.Ala911Val对应本研究发现的人类p.Ala968Val。值得注意的是，WDR34 p.Gly394Ser克隆同时携带一个顺式、功能影响可能较小的Wdr34 c.1178G>A/p.Gly₃₉₃Asp杂合改变，Wdr60 p.Ala911Val克隆则携带一个同义的下游杂合改变。

逆向IFT运输缺陷及Hedgehog信号紊乱：血清饥饿诱导纤毛后，三种中间链突变克隆的纤毛顶端均出现IFT88显著蓄积，提示逆向IFT受阻；WDR60 p.Ala911Val和WDR34 p.Arg183Trp细胞纤毛长度略有缩短，而成纤毛率未见明显降低。Hedgehog通路分析显示，SAG处理后对照细胞GLI3抑制片段（GLI3-R）与全长（GLI3-Fl）比值显著降低，而突变细胞无此反应，且基线GLI3-Fl水平升高，重现了dynein-2中间链功能障碍相关的Hedgehog信号缺陷。

人类疾病等位基因影响基因转录并提示dynein-2中间链功能障碍影响高尔基体蛋白运输：RNA测序显示，突变克隆与对照在纤毛化和非纤毛化细胞中均存在差异表达基因，纤毛化突变细胞中上调的基因通路涉及G蛋白偶联受体（GPCR）信号、软骨细胞发育、软骨内成骨及细胞外基质组织；共同下调的基因则涉及高尔基体和囊泡运输，如Rab6b、Elmod1、Myo5c、Zdhhc14等，同时Dcdc2a表达降低。莫能菌素-洗脱实验显示，突变细胞COPI阳性高尔基体区域的恢复延迟，而过表达野生型WDR34或WDR60可部分挽救这一表型，支持WDR34/WDR60除纤毛逆向IFT外还参与COPI-高尔基体功能调控。

讨论与结论：本研究说明，对于携带低形态错义等位基因的SRTD患者，全基因敲除模型并不适用，而碱基编辑模型能保留部分蛋白功能并更真实地重现患者细胞表型。研究结果与既往患者成纤维细胞及完全敲除动物模型中发现的逆向IFT缺陷和Hedgehog信号紊乱相符。更为重要的是，研究从转录组和高尔基应激实验中获得了WDR34与WDR60具有非纤毛功能的证据，可能通过Rab6b介导的COPI-高尔基体运输障碍影响骨骼发育所需的大量细胞外基质蛋白加工与转运，从而参与SRTD的病理过程。研究也指出一定的局限性，包括WDR34 p.Gly394Ser克隆中意外引入的杂合改变、结果均为体外数据尚需体内模型验证，以及部分信号通路需特定刺激下方可检出。

研究结论：总之，本研究利用碱基编辑技术成功构建了携带人类错义等位基因的SRTD疾病模型，证实了逆向IFT缺陷及Hedgehog信号传导紊乱，并进一步发现与人类疾病等位基因相关的COPI–高尔基体扰动证据，提示该异常可能与细胞骨架及细胞外基质组成改变共同促成dynein-2中间链功能障碍相关的严重骨骼表型。