机器学习辅助的三维打印细胞外基质模型构建

《ChemNanoMat》：Machine Learning-Assisted Fabrication of 3D-Printed Extracellular Matrix Models

　　

模拟细胞外基质（extracellular matrix，ECM）具有挑战性，这是由于天然组织具有复杂的组成、结构、形态以及力学性质，而这些恰恰是组织工程中的关键调控目标。三维打印可利用保留关键黏弹性与保水性能、从而支持细胞存活的水凝胶，以较高空间分辨率制备ECM模型。在本研究中，研究人员开发了一种机器学习（machine learning，ML）辅助方法，用于描述水凝胶的打印行为，并证明尽管可用数据集规模较小，仍具有预测可打印性（printability）的潜力。为制备水凝胶，明胶（gelatin）与透明质酸（hyaluronic acid）分别经γ-硫代丁内酯与半胱胺功能化。交联通过带有降冰片烯功能化的四臂聚乙二醇（4-arm-PEG functionalized with norbornene）参与的硫醇-烯（thiol–ene）光化学反应完成。所得配方首先通过溶胀实验评估其稳定性，并对最具前景的候选体系进一步开展化学、形貌及流变学表征。随后，采用人骨髓来源间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells，hBM-MSCs）活力实验验证其细胞相容性（cytocompatibility）。研究人员进一步采用立体光刻（stereolithography）实施高分辨率三维打印，以确认所筛选水凝胶的可打印性。基于上述结果，研究人员建立了一个初步预测性ML模型，用于估算并预测水凝胶的可打印性。

该论文发表于《ChemNanoMat》，研究聚焦于组织工程中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）仿生构建这一核心问题。天然ECM在成分、微观结构、形貌和力学性能上均高度复杂，而细胞黏附、骨架重构、铺展与谱系分化等关键生命过程又高度依赖这些微环境线索，因此如何构建兼具生物相容性、力学适配性与高分辨成形能力的ECM模拟材料，始终是组织工程的重要难题。传统水凝胶虽然在含水性、黏弹性及生物相容性方面接近天然组织，但在结构精度、打印稳定性以及配方优化效率方面仍受限制。尤其对于立体光刻（stereolithography）体系，如何在快速光交联、高结构保真度和细胞友好性之间实现平衡，仍缺乏系统方法。与此同时，机器学习（machine learning，ML）虽已在挤出式生物打印中开始用于材料与工艺优化，但其在光引发水凝胶立体光刻中的应用仍相对不足，因此开展本研究具有明确的方法学与应用价值。

围绕这一问题，研究人员设计了基于硫醇-降冰片烯（thiol–norbornene）光点击反应的明胶/透明质酸复合水凝胶体系，用于高分辨率三维打印支架的构建。明胶来源于胶原，具备良好的生物相容性、可降解性、低免疫原性及Arg-Gly-Asp（RGD，促进细胞黏附的肽序列）基序；透明质酸则为非硫酸化糖胺聚糖，具有良好的保水性、黏弹性及组织稳态调节作用。研究人员先分别将明胶与透明质酸引入硫醇（thiol，-SH）基团，再与四臂降冰片烯功能化聚乙二醇（4-arm-PEG-norbornene，PEG-NB）进行光交联，构建出多种不同组成比例的水凝胶配方。在对其稳定性、交联程度、流变学、压缩力学、微观形貌、细胞相容性及打印性能进行比较后，研究进一步建立了初步的ML预测框架，以配方中的反应基团摩尔数及交联度（degree of crosslinking，DoC）等具有化学意义的描述符为输入，对水凝胶可打印性进行预测。研究表明，该策略能够在小样本条件下仍保持较好的预测效果，其中结合数据驱动权重与DoC的模型性能最佳。这说明，将机理相关化学描述符与数据驱动分析结合，是提高光固化水凝胶可打印性预测能力的有效路径。该工作的意义在于，不仅构建了可用于ECM模拟的高精度打印水凝胶，也提出了一个面向小数据集的材料优化思路，为组织工程中可定制支架的快速开发提供了概念验证。

在技术方法方面，研究主要采用以下几类关键手段：首先，通过¹H-核磁共振（¹H-NMR）和Ellman法测定明胶与透明质酸的硫醇化程度；其次，以溶胀实验筛选稳定配方，并结合流变学振幅扫描、压缩测试和扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）评估其网络结构与力学特征；再次，采用人骨髓来源间充质干细胞（hBM-MSCs）开展间接细胞毒性、直接细胞相容性、Live/Dead及Phalloidin-DAPI染色分析；随后利用405 nm立体光刻三维打印系统评价打印精度、均一性与形状保真度；最后使用R语言构建线性回归预测模型，并以Python计算平均绝对误差（MAE）和均方根误差（RMSE）验证模型性能。

以下为论文主体结果的凝练解读。

3.1 Functionalization of Gelatin with Thiol Groups (Gel-SH)

研究人员通过γ-硫代丁内酯与明胶中赖氨酸侧链暴露氨基发生亲核反应，实现明胶硫醇化。¹H-NMR结果显示，2.9 ppm处赖氨酸ε-亚甲基质子峰明显减弱，同时出现2.55和1.53 ppm的新峰，证明硫醇邻近质子成功引入。Ellman法进一步定量显示其功能化程度（degree of functionalization，DoF）为7.03%，提示赖氨酸位点实现了充分功能化。这一步为后续硫醇-烯光交联提供了反应基础。

3.2 Functionalization of Hyaluronic Acid with Thiol Groups (HA-SH)

透明质酸则通过EDC/NHS介导的缩合反应与半胱胺偶联，从而引入硫醇基团。¹H-NMR中出现2.44、2.69和2.91 ppm的特征峰，证实半胱胺成功接枝。按照峰面积计算，总取代度为20.70%，其中自由硫醇对应的有效功能化程度为5.33%，与Ellman法得到的5.48%结果一致。进一步以DTT处理后，自由硫醇比例升至15.30%，说明还原处理可有效提高可交联基团数量。

3.3 Thiol–Ene Photoclick Hydrogel Formation

基于Gel-SH、HA-SH与PEG-NB，研究人员构建了六种不同配比的硫醇-烯光交联水凝胶。该体系在405 nm紫外光照下快速凝胶化，LAP作为光引发剂，DTT用于抑制硫醇氧化、提高交联效率。所有配方均能在光照后立即成胶，说明该点击化学体系具备快速成形能力。不同配方主要通过调节Gel-SH、HA-SH和PEG-NB浓度来改变交联密度与网络结构。

3.4 Swelling Test

溶胀实验在pH 5.5、7.4和8.5条件下进行，用于评价水凝胶在不同生理相关环境中的稳定性。结果表明，PEG-NB含量较高的GelHA_0.24_70PEG和GelHA_0.38_70PEG在不同pH下均表现出更好的结构稳定性；其中HA含量更高的GelHA_0.38_70PEG吸水更显著，符合透明质酸的保水特征。相比之下，50PEG和30PEG中的部分配方在中性或碱性条件下迅速降解，尤其30PEG组在各pH条件下均于7天内完全失稳。基于此，研究人员筛选出GelHA_0.24_70PEG、GelHA_0.38_70PEG及GelHA_0.24_50PEG用于后续分析。

3.5 Real-Time ¹H-NMR

为验证交联效率，研究人员比较了凝胶化前后配方的¹H-NMR谱图。PEG-NB中降冰片烯双键特征峰位于5.99和6.25 ppm，交联后明显减弱或消失，证明双键参与了硫醇-降冰片烯反应。定量分析表明，GelHA_0.24_70PEG、GelHA_0.24_50PEG和GelHA_0.38_70PEG的峰面积下降比例分别为68.3%、86.9%和89.9%。这一结果说明后两者交联程度更高，而70PEG中低HA配方仍存在一定未反应降冰片烯基团。

3.6 Amplitude Sweep and Compression Tests

流变学振幅扫描显示，三种入选水凝胶均具有相近的线性黏弹区（linear viscoelastic region，LVR），约延伸至1%应变范围；超过该范围后，损耗模量G''开始对应变敏感，而储能模量G'保持相对稳定至8%–10%应变。GelHA_0.24_70PEG具有最高G'与G''，说明更高PEG-NB浓度可增强网络黏弹性并降低可变形性。压缩实验则揭示出另一层规律：GelHA_0.38_70PEG表现出最高刚度与25%应变下的应力，提示HA含量对宏观力学强度的影响更为显著。由此可见，PEG-NB主要调控黏弹性质和交联密度，而HA对压缩力学支撑作用更突出。

3.7 SEM Analysis

SEM观察显示，各水凝胶冻干截面整体较均一，反映出硫醇-烯交联形成了较为致密的聚合物网络。GelHA_0.24_70PEG和GelHA_0.38_70PEG的孔径约为5 μm，而PEG-NB较低的GelHA_0.24_50PEG则出现20–100 μm的更大孔结构。该结果表明，较低PEG-NB含量会减少可反应降冰片烯基团数量，使网络更加疏松开放。

3.8 Indirect Cytotoxicity and Direct Cytocompatibility Tests

细胞学评价首先对GelHA_0.24_70PEG进行间接细胞毒性检测，因为该组PEG-NB含量更高且存在未完全反应的PEG-NB，被视为最严格情形。结果显示其与对照组相比无显著差异，且细胞活力均高于70%，符合非细胞毒性判定标准。随后，研究人员对三种候选水凝胶进行直接细胞相容性评价，并比较两种接种方式：交联后表面接种与交联前包埋接种。代谢活性结果表明，培养早期各组差异不大，但从第10天起表面接种组明显优于包埋组，到第21天这种差异进一步扩大。说明在该相对致密且较硬的网络中，细胞更适于先附着于表面，再逐步适应和迁移。

3.9 Morphological Characterization of Cells

Live/Dead与Phalloidin-DAPI染色进一步揭示了细胞形态差异。包埋在水凝胶内部的hBM-MSCs在21天内大多保持圆形，分布较均匀，仅局部密度略增加，提示高刚度和低孔隙限制了其铺展。表面接种组则在早期形成细胞团，随后逐渐伸长并向水凝胶内部迁移。定量核圆度分析显示，Gel含量较高且表面接种的配方具有更低圆度值，说明细胞更易拉长并增强黏附；而高刚度配方圆度值更高，表明基质刚性仍是限制细胞延展的主导因素。尽管如此，各组细胞活率均超过95%，总体证明材料具有良好细胞相容性。

3.10 3D Printing Test

三维打印实验采用405 nm立体光刻系统和细网格STL模型，以系统评估不同配方的高分辨成形能力。三种候选水凝胶均成功打印出与设计模型相近的网格结构，且在PBS中孵育5天后虽发生溶胀，但仍保持整体三维形态。定量上，扩展比（spreading ratio，SR）均接近1，说明打印线宽与理论值高度一致；打印精度（printing accuracy，PA）方面，Gel含量较高配方表现更佳，其中GelHA_0.24_50PEG达到96.4%；均一因子（uniformity factor，UF）均低于1，说明孔形略趋圆钝，但整体保真度仍处于可接受水平。这些结果说明该体系适于高分辨率立体光刻打印。

3.11 Preliminary Predictive Model for Printability

在实验数据基础上，研究人员构建了初步可打印性预测模型。首先比较材料组成参数与机械参数对打印性的解释能力，结果显示前者相关性更强，因此将Gel-SH、HA-SH和PEG-NB的反应基团摩尔数作为主要输入，而非简单质量。随后引入先前因溶胀不稳定而未入选的配方，以扩充小样本数据集。研究共建立5种线性回归模型，区别在于打印性指数的权重设定方式，以及是否将交联度DoC作为输入变量。模型验证采用3种新配方，并将理论预测值与实际打印所得可打印性指数比较。结果显示，经验赋权的Model 2误差最大，表现出明显过拟合；数据驱动赋权的Model 3明显改善；纳入DoC后模型进一步优化，其中Model 5，即“数据驱动权重+DoC”组合表现最佳，MAE为0.0773，RMSE为0.1011。该结果表明，即使在小样本条件下，只要采用具备机理意义的化学描述符并结合数据驱动赋权，仍可获得相对稳健的预测性能。

讨论部分指出，本研究的核心贡献在于将硫醇-烯光交联水凝胶设计、高分辨率立体光刻打印与小样本机器学习预测有机结合。实验结果共同说明：PEG-NB含量主要影响交联密度与流变学行为，HA含量更显著影响压缩力学强度，而网络致密性和较高刚度虽然提升了打印稳定性与结构保真度，却在一定程度上限制了细胞在凝胶内部的迁移与铺展。因此，该体系体现出“打印精度—细胞迁移性”之间的典型权衡。研究人员进一步强调，尽管数据集规模有限，但通过使用反应基团摩尔数、DoC等化学上有解释力的描述符，能够降低小样本建模中的过拟合风险，并提高模型局部预测稳定性。论文同时指出，目前模型尚未纳入生物学性能指标，未来应在扩大数据集基础上引入生物铺展评分等参数，并探索可降解交联剂，从而实现打印性能与生物学性能的联合预测。

研究结论部分可译为：本研究聚焦于Gel-SH和HA-SH水凝胶在高分辨率立体光刻三维打印中的优化。利用硫醇-烯光交联，研究人员制备了相较于传统挤出式方法具有更高结构保真度的构建体，同时维持了适于hBM-MSCs存活的生物相容环境。所筛选配方表现出合适的力学性能，且生物学实验验证了其支持细胞黏附与增殖的能力。本研究的重要贡献之一，是建立了一个即使在有限数据条件下仍可发挥作用的ML预测框架。通过整合DoC和官能团比例等机理性描述符，该模型获得了更优的预测性能，凸显了化学机理认知与数据驱动方法结合的优势。该工作本质上属于概念验证，因为MAE和RMSE是在小数据集上评估得到，解释时需保持谨慎。在这一背景下，这些指标主要用于方法学比较，而非普适性验证；较低的RMSE-MAE差值提示由机理描述符驱动的局部预测具有一定稳健性。较高的交联密度保证了结构稳定性，但也可能限制细胞迁移，这是未来研究需要权衡的关键问题。后续工作将着重于整合生物学描述符、定义生物铺展评分，并引入可降解交联剂。总体而言，这种ML引导策略通过减少实验试错，加速了生物材料优化，并为设计高精度、可定制、模拟ECM的组织工程支架提供了有力的概念验证。