综述：纳米孔直接RNA测序：从技术原理到生物学发现及临床转化

《iMeta》：Nanopore direct RNA sequencing and the epitranscriptome: Advances in mapping native RNA landscapes

　　

研究人员对纳米孔直接RNA测序（Direct RNA Sequencing, DRS）的技术进展及其在多层面RNA生物学研究中的应用进行了系统性综述。DRS能够在无需逆转录与PCR扩增的前提下，对天然RNA分子进行单分子、全长测序，并同步检测RNA化学修饰、poly(A)尾特征及转录本结构异质性。该技术通过解析离子电流信号的变化，实现了在单碱基分辨率下对N6-甲基腺苷（m6A）、5-甲基胞嘧啶（m5C）、假尿苷（Ψ）及2'-O-甲基化（Nm）等多种表观转录组修饰的直接识别。相较于短读长RNA测序（srRNA-seq），DRS能够准确解析可变剪切（Alternative Splicing, AS）、可变多聚腺苷酸化（Alternative Polyadenylation, APA）及融合转录本等传统方法难以捕获的复杂转录本结构。研究人员指出，DRS已在病毒与病原体转录组学、原核生物及宏转录组学、植物发育与环境响应、动物模型与器官发育以及医学与疾病研究领域展现出重要价值。在临床转化方面，DRS为RNA疫苗与药物的质量控制、生物标志物发现及精准医疗提供了全新的技术平台。尽管DRS在碱基检出准确率及RNA修饰定量的标准化方面仍面临挑战，但随着测序化学、生物信息学算法及标准化工作流程的持续优化，该技术正逐步成为解析转录组复杂性及调控机制的核心工具。

DRS揭示的转录组异构体与表观转录组多样性

DRS的应用揭示了跨物种及不同生物学背景下广泛的异构体异质性。在拟南芥（A. thaliana）、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）及人类癌症模型等生物体中，DRS研究在每个物种、组织或发育条件下鉴定出数万个先前未注释的全长异构体。这种多样性反映了转录起始、外显子使用及转录终止的受调控变异，而不仅仅是随机的转录噪音。DRS进一步揭示了转录本3'端的精细多样性，包括广泛使用的可变及内含子多聚腺苷酸化位点。此类事件可产生截短的转录本，编码功能改变或新颖的蛋白质变体，例如在雌激素反应性乳腺癌中TLE1的内含子多聚腺苷酸化，产生了功能不同的蛋白质变体。同时，DRS能够在动物、细菌及植物中绘制特定转录本背景下的表观转录组特征，如m⁶A和m⁵C修饰，这些修饰通常与组织或条件特异性表达模式及特征性的poly(A)尾特征相关。综合证据表明，大多数基因表达多种异构体，其在转录起始位点（TSS）使用、非翻译区及末端外显子方面存在受调控的差异。许多此类异构体改变了蛋白质编码潜能或引入了独特的转录后调控元件，从而影响蛋白质截短、定位、稳定性及翻译效率。

可变剪切与定量异构体调控

可变剪切（AS）是转录组多样性的主要贡献者，也是发育与疾病的核心机制。超过90%的人类多外显子基因及约80%的植物基因经历AS，包括外显子跳跃、内含子保留、可变5'或3'剪接位点使用及互斥外显子，这些事件共同重塑了蛋白质编码潜能及转录后调控元件。短读长测序（srRNA-seq）由于依赖片段化读段间接推断异构体，往往难以准确解析此类复杂性，并常在外显子或基因水平上合并不同的转录本变体。DRS能够直接、无需组装地识别全长剪切异构体，为解析复杂且协调的剪切模式提供了更高的分辨率，这对于短读段重建而言极具挑战性。这一能力尤其适用于检测新颖或低丰度的异构体，否则它们将被遗漏或错误组装。全长异构体的定义为改进异构体使用情况的定量提供了基础。基于长读段的工具如LIQA和NanoCount利用长读段特性估算异构体丰度，并以比基于短读段的方法更高的特异性检测差异剪切或异构体转换。例如，在人类神经元分化过程中，基于DRS的分析鉴定了数千个先前未注释的异构体，并揭示了数百个差异表达的异构体及异构体转换，凸显了除基因水平表达变化之外的显著转录水平调控。由于长读长测序捕获了完整的转录本结构，包括非翻译区（UTRs），它为将剪切与下游功能调控相结合奠定了基础。异构体分辨率的转录本模型使得研究人员能够探究异构体特异性的翻译调控，例如可变UTRs、保留的内含子或易触发无义介导衰变的异构体如何在不改变总RNA丰度的情况下调节翻译效率。长读长测序的另一个优势在于其支持等位基因特异性表达（ASE）及单倍型分辨率的异构体分析。跨越多个杂合变异位点的长读段允许将转录异构体直接定相至亲本单倍型，从而实现等位基因特异性剪切及表达的鉴定。

Poly(A)尾动力学与3'端调控

可变多聚腺苷酸化（APA）是一种普遍存在的塑造转录组多样性的机制，也是决定RNA稳定性、亚细胞定位及翻译输出的主要因素。通过选择不同的切割位点及多聚腺苷酸信号（PAS），APA产生具有不同3' UTR甚至改变的编码序列的mRNA异构体，从而重塑转录后调控程序。DRS因其测序起始于RNA分子的天然3'端并贯穿整个poly(A)尾，而成为研究APA的独特工具。这提供了转录终止位点的直接证据，使得即使在复杂或异质性样本中，也能改进跨转录异构体的多聚腺苷酸位点使用情况绘图。相比之下，短读长APA方法通常从读段覆盖模式推断多聚腺苷酸位点，且常依赖于先前的注释，这可能掩盖复杂的异构体结构及协调的RNA加工事件。通过读取天然切割位点及poly(A)尾，长读段及基于DRS的方法直接解析了异构体特异性的3'端，避免了与转录本重建相关的模糊性。当结合专门的尾分析工具时，ONT DRS能够实现单个分子水平的多聚腺苷酸位点使用、尾长度及尾组成的分配。这一异构体分辨率的视角具有重要价值，因为超过一半的人类基因使用多个多聚腺苷酸位点。Poly(A)尾长度本身是动态且受发育调控的，对RNA稳定性及翻译控制具有重要意义。全基因组研究表明，在许多非胚胎系统中，高表达且高效翻译的mRNA通常携带相对较短的稳定态poly(A)尾。尾长度与RNA半衰期及通路特异性调控程序关联更为紧密，而非统一预测翻译效率。此外，非腺苷酸残基（如尿苷化、鸟苷化或混合尾）的广泛掺入通过调节RNA衰变及稳定性增加了另一层调控。最近的DRS方法现在能够检测内源性及治疗性mRNA中poly(A)尾内的内部非A残基。重要的是，APA与poly(A)尾调控与其他RNA加工步骤紧密互作。DRS及PacBio的Iso-seq分析表明，来自同一基因的异构体之间的poly(A)尾长度和组成可能系统性地变化，支持剪切决策、切割位点选择及尾调控被共同调节以塑造RNA稳定性及命运的观点。

RNA化学修饰与表观转录组多样性

RNA化学修饰通过调节RNA结构、稳定性、剪切、定位及翻译，为转录组多样性增加了关键维度。与基于抗体的富集或化学转化方法不同，纳米孔DRS在天然RNA分子穿过纳米孔时，通过离子电流信号的特有扰动直接检测RNA修饰。因此，DRS可用于从纳米孔电流信号推断几类RNA修饰，特别是在结合专门的修饰识别模型时，可在单分子及单核苷酸分辨率下进行推断。SQK-RNA004孔蛋白化学及Dorado等碱基识别模型的最新进展，使得能够实施修饰感知的碱基识别模型，可推断m⁶A、Ψ、m⁵C、Nm及肌苷，提高了基准数据集的准确率及F1分数。然而，正交验证仍然至关重要，特别是对于低化学计量比或依赖环境的修饰。DRS的主要优势在于保留了全长转录本背景。长读段允许将修饰识别分配给特定的剪切及APA异构体，而不是在基因或外显子水平上聚合。这种异构体分辨率的视图至关重要，因为RNA修饰通常表现出变体特异性的分布，而这些分布在短读段或基于富集的方法中被掩盖。社区资源如DirectRMDB现在汇总了跨越多种修饰类型的数十万个DRS衍生的修饰位点，并明确支持表观转录组模式的异构体水平探索。分析工具如R2Dtool进一步将异构体映射的修饰位点与开放阅读框、剪切连接点及非翻译区整合，从而能够系统分析修饰景观如何随AS或3'端选择而变化。基于DRS的研究已开始阐明RNA修饰与其他RNA加工层之间的协调调控。例如，在人类白血病细胞中，长读段DRS能够联合分析m⁶A沉积、poly(A)尾长度、转录本丰度及剪切，揭示了干扰m⁶A写入酶后的协调的转录本特异性变化。此类分析证明了化学修饰如何在高度环境依赖性的方式下与RNA加工及稳定性相互作用。广泛研究的修饰，包括m⁶A、m⁵C、Ψ及A-to-I编辑，已被证实参与调节剪切、核输出、RNA衰变、翻译及亚细胞定位，并与癌症、心血管疾病及遗传性疾病相关。在植物中，基于纳米孔的m⁶A分析已从概念验证进展到定量基准应用。总之，这些进展确立了纳米孔DRS作为一种重要的技术，用于在其天然异构体背景中绘制RNA化学修饰图谱。通过揭示单个RNA分子上的变体特异性及组合性表观转录组程序，DRS为理解转录组的功能多样性及其在发育、疾病及治疗反应中的作用提供了深入见解。

非经典及非编码RNA物种的发现

除了蛋白质编码转录本外，DRS通过实现对非经典RNA物种的系统性发现与表征，大幅扩展了研究人员对转录组多样性的理解。长链非编码RNA（lncRNAs）、环状RNA（circRNAs）、转运RNA（tRNAs）及其他小型或高度结构化的RNA通常因大小、二级结构、低丰度或缺乏多聚腺苷酸化而被常规RNA-seq方案捕获不足。DRS在lncRNA分析中尤为强大，因为它能以天然状态捕获长且通常低丰度的转录本，保留其5'和3'边界、剪切模式及poly(A)尾特征。这克服了与poly(A)富集或非链特异性srRNA-seq相关的偏差，后者经常遗漏非多聚腺苷酸化的lncRNA或错误分配转录本方向。在拟南芥中，DRS与低丰度感知的异构体发现整合，鉴定了超过1100个先前未注释的lncRNA，并揭示约三分之一的lncRNA缺乏poly(A)尾。此外，poly(A)尾长度及m⁶A修饰状态被证明共同调节lncRNA丰度及稳定性，强调了异构体分辨率分析的重要性，特别是在疾病背景下，可能仅特定lncRNA变体具有功能。CircRNA代表了另一类受益于长读长测序的非经典转录本。由于circRNA是非多聚腺苷酸化的，其检测通常需要核糖体RNA（rRNA）去除或专门的富集策略。长读段纳米孔方法已成为重建全长circRNA序列及定义其外显子组成的关键。这些研究强调了长且连续的读段对于区分低表达circRNA与线性异构体，以及精确绘制反向剪切连接点及内部结构的重要性，这对功能表征及生物标志物发现至关重要。tRNA由于其短长度、广泛的二级结构及密集的化学修饰而带来了独特的技术挑战。定制的纳米孔DRS方案及分析流程，包括直接tRNA接头、Nano-tRNA-seq策略及更新的孔蛋白化学，现在能够以单分子分辨率对全长tRNA进行端到端测序。这些方法允许同时量化tRNA同工受体丰度并检测单个分子上的众多修饰类型，揭示了tRNA结构元件（如T环）内的协调“修饰回路”，以及应激或条件特异性的tRNA库重塑。DRS与LC-MS/MS及互补的表观转录组分析的结合进一步使得能够对结构化的非编码RNA及其动态修饰状态进行全转录组规模的绘制。综上所述，在lncRNA、circRNA、tRNA及其他结构化或非经典RNA方面的证据表明，纳米孔DRS大幅扩展了可检测的转录组。通过提供完整的转录本结构、天然加工状态及修饰景观，DRS为探索生物学及疾病中非编码及非经典RNA物种的功能多样性提供了一个全面的框架。

RNA结构与构象异质性

RNA结构是转录组多样性的内在组成部分，影响RNA稳定性、亚细胞定位以及与蛋白质和RNA的相互作用。经典的RNA结构探测方法依赖于化学修饰或酶消化，通常需要独立于转录组分析的专门实验流程。DRS提供了一种互补的、基于信号的策略，通过捕获离子电流及停留时间的变化来反映RNA在穿过纳米孔时的二级和三级结构。在DRS中，马达酶将天然RNA分子送入生物纳米孔，核苷酸序列及其结构背景都会影响产生的离子电流及易位动力学。碱基配对区域、稳定的二级结构及用于结构探测的化学加合物都能以特征性的方式扰乱电流强度及停留时间。多项概念验证研究证明了该方法的可行性。例如，nanoSHAPE框架表明，rRNA中的SHAPE加合物及内源性修饰在单分子、长读段分辨率下产生可重复的电流及停留时间偏移，从而能够同时进行测序及结构探测。在互补的单分子系统中，工程化的逆转录酶与MspA纳米孔耦合，揭示了酶的步进动力学对下游RNA二级结构敏感，从而无需预先的cDNA转化即可直接检测结构化区域。相关策略利用解旋酶“刹车”点的停留时间扰动来区分Ψ与尿苷，并推断病毒及细菌RNA中依赖于修饰的结构稳定。这些研究共同表明，结构化或碱基配对的RNA区域与灵活、非结构化的片段相比，产生不同的信号特征，尽管将结构效应与化学修饰的效应解卷积仍然是方法学发展的活跃领域。由于DRS产生全长读段，结构敏感的信号原则上可以沿着整个转录本连续映射，并与AS模式、非翻译区及表观转录组修饰一起进行分析。通过这种方式，DRS方法补充了全转录组化学及酶学结构作图方法，将结构信息嵌入到天然转录本结构中。RNA结构在调节AS、RNA-蛋白质相互作用及重复序列相关的毒性功能获得机制中起核心作用，其破坏会导致癌症、神经退行性疾病及重复扩增性疾病。疾病相关的单核苷酸变异可作为riboSNitches，改变局部或远程RNA结构，从而重塑剪切决策、RNA稳定性或RNA结合蛋白亲和力。将DRS衍生的结构信号与异构体分辨率的修饰图谱及转录本谱整合，提供了一种有前景的策略，以精确定位变体或异构体特异性的结构变化，这些变化在疾病中重新连接转录后调控及翻译控制。sm-PORE-cupine将化学探测与直接RNA测序整合，以单分子分辨率绘制RNA结构集合。通过揭示异构体特异性的结构异质性并将这些集合与翻译效率及RNA稳定性联系起来，该方法为复杂转录组中RNA结构-功能关系提供了宝贵的见解。综上所述，目前的证据支持纳米孔DRS作为一种有前景的、虽仍在成熟中的、基于信号的补充技术，用于化学及酶学RNA结构探测。其将RNA结构特征与单个分子上的全长异构体、化学修饰及疾病连锁序列变异联系起来的能力，使DRS成为研究健康和疾病中RNA构象异质性的新兴工具。

融合及转座子相关转录本的鉴定

融合转录本可由通读转录、转座子（TEs）介导的重排、结构变异或罕见的反式剪切事件产生。基于cDNA的RNA-seq容易产生由逆转录产生的假性嵌合体，使解释复杂化。DRS通过消除逆转录及PCR，减少了融合伪影的一个主要来源，并能够直接检查跨越断裂点的天然RNA分子。与此同时，长读段融合检测对定位错误及注释缺口仍然敏感，特别是在重复序列丰富的植物基因组中。因此，使用DRS鉴定融合转录本时应谨慎解释，并得到正交证据的支持。在植物系统中，一个有前景的方向是将类融合转录本与TEs活性及基因组进化联系起来，而不是仅仅将其视为孤立的异常。拟南芥分析表明，基因内TEs可作为调控模块，与宿主基因共转录，其表观遗传状态调节RNA聚合酶II延伸以及嵌入TE序列中的APA信号的使用，从而塑造替代性TE-基因转录异构体的产生。这些应用共同定义了一个以DRS为中心的RNA生物学图谱。通过联合观察RNA修饰、异构体结构、转录终止、非经典RNA物种、结构信号、TE相关多样性及融合事件，DRS为整合转录组分析奠定了连贯的基础。

DRS技术的典型应用场景与突破性发现

病毒与病原体转录组学

DRS已成为研究病毒及病原体转录组的有用技术。与传统基于cDNA的测序方法不同，DRS能够对全长天然RNA分子进行测序，无需逆转录或扩增，从而保留了链信息、转录本结构及RNA修饰特征。这些特征促进了对病毒基因表达调控、表观转录组调控及传染病原体快速检测的新分析。RNA修饰构成了宿主及病毒基因表达的重要调控层。纳米孔DRS能够保留天然的全长RNA读段，同时捕获修饰相关的离子电流扰动，为短读长、基于抗体或化学的作图方法提供了互补的替代方案，后者通常会片段化分子并丢失异构体连接。使用DRS，已在多种病毒基因组的转录本中广泛表征了RNA修饰，包括DNA病毒（如腺病毒）及RNA病毒，如SARS-CoV-2、HIV、乙型肝炎病毒（HBV）、竹花叶病毒（BaMV）及黄瓜花叶病毒（CMV）。研究已证实，m⁶A修饰对腺病毒晚期转录本的剪切效率至关重要。对SARS-CoV-2的研究发现m⁶A修饰富集于病毒基因组3'端。两项针对HIV的研究揭示了异构体依赖性的甲基化模式及独特的2-LTR转录本修饰，并鉴定了病毒RNA 3'端附近的几个关键m⁶A位点，它们是正常HIV-1 RNA剪切及蛋白质翻译的关键调节因子。将DRS应用于HBV转录本，研究人员鉴定了四个高置信度的m⁵C位点，证明HBV mRNA被广泛m⁵C修饰，突显了DRS在精确、转录本分辨率的病毒表观转录组作图中的能力。DRS还被用于检测病毒RNA上的其他修饰，如Ψ及Nm。然而，结合DRS与互补方法的整合研究揭示了某些RNA病毒中缺乏显著的m⁶A修饰位点。总体而言，病毒中RNA修饰的位点及频率相对较低，未来的研究需要更多的实验来进一步确认这些潜在修饰在病毒感染中的功能。除了病毒，DRS也被用于检测其他病原体中的RNA修饰。使用无修饰的体外转录（IVT）样本作为阴性对照，研究人员应用纳米孔DRS实现了大肠杆菌及金黄色葡萄球菌中全转录组范围的RNA修饰检测。除了表观转录组分析，纳米孔测序的长读段特性使得能够在全长转录本背景下进行修饰检测，允许研究人员将表观转录组标记与特定异构体、亚基因组RNA或转录变体联系起来。这种整合视图对于具有紧凑多功能基因组的RNA病毒特别有价值。许多病毒表现出高度复杂的转录策略，包括嵌套转录、重叠的开放阅读框及广泛使用亚基因组RNA。纳米孔DRS凭借其产生全长天然RNA读段的能力，极大地推进了病毒RNA结构变异的发现。例如，对SARS-CoV-2的纳米孔DRS揭示了高度复杂的转录组，包含大量先前未注释的亚基因组RNA、可变转录调控连接点及非经典融合转录本。类似的方法应用于1型单纯疱疹病毒，揭示了广泛的可变转录起始及PAS，以及通读及反义转录，突出了感染期间出乎意料的转录异构体多样性。研究人员还在多种RNA病毒中发现了先前未注释的转录异构体、可变转录起始及终止位点以及通读转录事件。除了异构体发现，DRS能够链特异性地定量基因组及抗原组RNA，为正义及负义RNA病毒的复制及转录动力学提供了见解。在分节段或易发生重组的病毒中，长读段有助于解析可能在病毒进化或致病性中起作用的嵌合RNA及融合转录本。这些研究共同证明，纳米孔DRS特别适合解析病毒转录组的结构复杂性，提供了短读长测序技术通常无法获得的RNA结构整合视图。在许多临床或环境样本中，病原体来源的RNA仅占总RNA的一小部分，这对直接测序提出了挑战。为了解决这一问题，已开发了靶向及富集策略以增加DRS文库中病原体转录本的占比。宿主RNA耗竭策略，如核糖体RNA去除、poly(A)选择及大小选择，可大幅减少压倒性的宿主来源转录本背景，从而增加测序文库中病原体RNA的相对丰度。适应性采样（Adaptive sampling）提供了纳米孔测序独有的、软件控制的富集方法，其中分子的一小段信号被实时分析并与参考序列比较；匹配目标病原体基因组的读段被接受并允许继续测序，而非目标（如宿主）分子则通过反转电压并从孔中弹出而被拒绝，从而在运行期间富集病原体来源的分子。实验评估显示，在最佳长读段条件下，合成模拟群落中的稀有物种富集高达约14倍，在考虑因读段拒绝导致的产量损失后，有效富集约为5倍。除了ONT内置的适应性采样策略，还开发了多种计算工具以实时实施适应性采样。基于信号的方法如UNCALLED及Sigmap直接将原始电流迹线与参考衍生的信号模型进行比较，以在完全测序之前快速分类分子。基于序列的方法包括Readfish、ReadBouncer及RUBRIC，首先执行超快速碱基识别，然后将短的初始序列片段与参考基因组比对，以决定是否保留或拒绝读段。SquiggleNet采用直接在原始纳米孔电信号上训练的卷积神经网络，以实时将分子分类为目标或非目标，无需碱基识别或全长序列比对。这些工具共同为病原体富集及靶向测序提供了灵活的策略。尽管用途广泛，ONT适应性采样在转录组应用中仍面临若干限制。mRNA分子的相对较短长度减少了早期读段拒绝的潜在收益，而碱基识别及比对的延迟通常意味着在做出决定之前，每个分子的大部分已被测序。频繁的拒绝事件也会降低孔利用率及总体测序产量。纳米孔测序最重要的优势之一是其实时数据生成能力。纳米孔DRS能够从临床或现场样本中快速检测RNA病原体，测序与分析同时进行。这一概念已在多项研究中得到证明，例如在PRRSV的临床样本中，DRS在测序开始后数小时内获得了接近完整的病毒基因组及毒株水平信息，实现了准确的毒株鉴别及共感染检测。实时测序允许在测序运行完成前早期鉴定病毒种类及毒株。此外，由于DRS保留了天然RNA分子，它提供了检测RNA修饰与序列信息相结合的独特潜力，提升了监测与毒力、宿主适应或抗病毒耐药性相关的表观转录组特征的希望。随着便携式纳米孔平台的持续改进，基于DRS的工作流程在分散或资源有限的环境中也变得越来越可行。这为现场病原体监测、快速疫情监控以及将转录组及表观转录组数据整合到公共卫生决策中开辟了新的机会。

细菌、古菌及宏转录组

迄今为止，DRS在细菌、古菌及宏转录组中的应用较少，主要是因为缺乏与非多聚腺苷酸化RNA分子兼容的商业试剂盒。然而，随着最近的技术进步，这种方法正成为解析细菌、古菌及群落水平宏转录组的强有力手段，能够从多层生物调控中检索信息。在原核生物中，DRS的一个主要应用是对初级转录本结构进行单分子、全长表征。在副溶血性弧菌中，酶促poly(A)加尾后进行的DRS实现了对TSS、TTS及操纵子结构的全面作图，揭示了许内部及反义TSS实际上源于重叠基因，并量化了单个操纵子内高度复杂的转录单元组合，从而细化了源自srRNA-seq的注释。在功能上，该策略已用于解析肺炎克雷伯菌的抗生素耐药谱，同时分析质粒携带的耐药基因含量及其瞬时表达水平；在约10小时内，可检测到≥35%的耐药基因的表达信号，并可描绘由耐药决定簇（如rmtB-blaTEM-1及aac(6′)-Ib-cr-blaOXA-1-catB4）组成的多个共转录操纵子。在大肠杆菌中，天然RNA读段揭示了TSSs、TTSs、5'/3' UTR及操纵子组织的广泛异质性，并显示了远超过短读段数据重建的转录异构体多样性。在植物病原体Dickeya dadantii中，毒力相关基因通常嵌入复杂的条件依赖性转录单元中，其组成及边界对环境线索的反应发生显著变化。在金黄色葡萄球菌中，天然RNA读段使得能够构建“不连续操纵子图谱”，鉴定了许多分裂、交织或重排的操纵子，挑战了严格连续操纵子的传统观点。跨多种细菌及古菌物种的比较分析进一步表明，古菌通常表现出丰富的无帽mRNA、非典型的起始及终止模式以及不规则的转录单元，这些特征很难从短读段重建。DRS也非常适合探究rRNA及tRNA修饰及其在环境胁迫下的动态重塑。早期针对16S rRNA的工作证明，DRS可以在天然16S分子中区分经典核苷酸与修饰核苷酸，提供了修饰状态的直接的、信号水平的读数。随后对大肠杆菌核糖体的系统分析使用DRS解析了36个位点上的17种不同的RNA修饰，能够同时检测30S及50S亚基中的多个修饰位点。抗生素挑战实验进一步表明，靶向核糖体的药物会触发A位点和P位点区域周围修饰的显著丢失及重连，这些在DRS数据中表现为特征性的“修饰丢失指纹”。热休克及其他扰动诱导大肠杆菌中rRNA及tRNA修饰景观的广泛重塑，并且许多先前通过抗体富集方法报道的mRNA修饰实际上可能比最初提出的要少得多。除了rRNA，DRS使得能够对tRNA结构、加工及修饰进行单分子剖析。对单个全长tRNA的直接纳米孔测序表明，即使是高度结构化、高度修饰的tRNA也可以从5'到3'连续读取，序列及修饰信息保留在同一分子中。这一概念验证建立了功能研究的技术基础，证明同工受体及同解码tRNA可以根据其分子特异性的修饰特征进行区分。鉴于古菌rRNA及tRNA通常含有异常密集且化学多样的修饰，全长天然读段为追踪修饰模式随时间成熟的轨迹以及它们如何促进古菌对极端环境的适应提供了独特的机会。在铜绿假单胞菌克隆C中，DRS在一个实验中捕获了毒力因子、耐药决定簇及代谢调节因子的条件依赖性转录程序。在铜绿假单胞菌中，tRNA羟基化已被确定为代谢状态及随之而来的致病性的关键表观转录组调节因子；来自DRS的全长、保留修饰的tRNA读段允许将特定的修饰组合直接与毒力表型联系起来。在大肠杆菌中，NAD tagSeq II与DRS的整合揭示了全转录组范围内NAD⁺加帽的显著生长阶段依赖性变化，表明这种氧化还原连接的5'修饰充当了代谢状态及生长动力学的分子传感器。同样，RNA介导的免疫途径可以直接通过DRS监测。例如，在RNA激活的Cas12a3防御系统中，Cas12a3切割tRNA尾以执行抗菌免疫，由此产生的切割及加工模式是可检测的。这些研究共同说明了DRS如何将RNA修饰及加工事件与细菌及古菌中的核心功能表型（如毒力、胁迫耐受性及免疫）联系起来。在群落水平，DRS已应用于宏转录组及临床环境。DEMINERS框架提高了DRS数据的通量及准确性，使得能够对复杂临床标本进行比较转录组分析，并提高了病原体检测及表达谱的分辨率。在食品安全领域，将直接宏转录组学与多重RT-PCR扩增子测序相结合，允许在复杂食品基质中同时检测存活的病原体，DRS提供了病原体存在及毒力基因活跃表达的直接证据。在环境研究中，针对纳米孔DRS优化了RNA提取方案，实现了从高抑制性基质中进行土壤宏转录组分析，促进了活跃微生物群及其表达的功能通路的表征。在海洋生态系统中，对浮游甲壳类群落的基于DRS的宏转录组学揭示了群落组成及功能基因表达的季节变化，强调了DRS在原位时间系列监测活跃微生物组方面的潜力。目前，宏转录组DRS中的修饰分析仍主要局限于全局趋势或丰富的rRNA/tRNA物种，精确绘制低丰度mRNA修饰位点仍然具有挑战性。最后，针对制备天然且未修饰的细菌RNA的标准化方案，连同匹配的IVT对照，为这些研究提供了稳健的实验及分析基础。总体而言，DRS在原核系统及其宏转录组中的应用正迅速从纯粹的结构转录组学向整合的表观转录组学、功能及生态学分析演变。

植物发育与环境响应

植物生长、发育及环境适应依赖于跨越RNA生物学多个层面的紧密协调调控，包括转录本结构、选择性加工、多聚腺苷酸化、RNA修饰及非编码RNA的活性。历史上，这些层面主要通过不同的实验策略进行研究，主要是用于表达及剪切的srRNA-seq、用于APA的3'端测序以及用于RNA修饰的基于抗体的方法，导致数据碎片化且缺乏分子连接。因此，很难确定不同的RNA调控特征是否共存于相同的转录本分子上，或在给定的发育或胁迫背景下独立发挥作用。DRS通过能够在天然RNA分子上同时询问多个RNA特征，提供了一项技术进步。在许多植物物种中，这种整合能力已开始揭示先前无法获得的协调的RNA调控状态。一个代表性例子来自水稻，基于DRS的分析联合分析了多个组织中的m⁶A及m⁵C修饰。在不同组织中检测到携带两种修饰的3389至14499个修饰转录本，表明先前分开作图的表观转录组标记广泛共存。重要的是，这些修饰并非均匀分布于基因的所有转录异构体上；相反，特定的异构体，通常由可变3'端或末端外显子使用定义，表现出优先修饰，暗示了RNA加工与表观转录组调控之间的紧密偶联。在拟南芥中，天然RNA的直接测序显示，m⁶A修饰的转录本经常显示出与未修饰转录本不同的poly(A)尾长度，特别是在胁迫条件下。除了蛋白质编码RNA，DRS已将多层分析扩展到lncRNA。研究人员同时分析了来自拟南芥的1149个新型lncRNA及其m⁶A修饰和poly(A)尾特征，揭示了相对于蛋白质编码RNA降低的甲基化水平、m⁶A对lncRNA丰度的积极作用，以及poly(A)尾对lncRNA稳定性的长度非依赖性贡献。这些研究阐明了DRS如何将植物RNA研究从孤立特征的平行分析扩展为协调RNA状态的整合视图。纳米孔DRS使得研究人员能够深入了解植物如何在发育过程中微调基因表达，构成了植物中问题驱动型发现的基础。植物持续暴露于波动的环境条件及病原体挑战，需要快速且可逆的基因表达重编程。虽然胁迫下的转录诱导及抑制已使用srRNA-seq进行了广泛表征，但越来越多的证据表明，植物的胁迫适应严重依赖于转录后调控。传统方法的一个主要局限是这些调控层通常是分别检测的，使得很难确定它们在胁迫反应中是如何在相同的RNA分子上协调的。DRS通过能够对胁迫植物组织中的多个RNA特征进行整合分析，开始应对这一挑战。在拟南芥中，盐胁迫下的基于DRS的分析揭示了mRNA加工及RNA修饰景观的广泛重塑。这些研究表明，胁迫响应基因频繁表现出APA、异构体使用及m⁶A修饰的协调变化，而不是任何单一层面的孤立改变。重要的是，m⁶A修饰的转录本在胁迫下显示出不同的稳定性及蛋白质输出谱，将表观转录组调控直接与生理结果联系起来。类似的层间调控模式也在其他作物物种中观察到。在短期盐胁迫暴露的玉米根中，DRS揭示了广泛的胁迫诱导转录组重组，包括2223个差异表达异构体、减少的poly(A)尾长度及降低的m⁵C信号。这些发现强调，作物中的胁迫反应不仅限于基因表达水平的变化，还涉及转录本结构及化学修饰的协调重配置，这可能有助于胁迫耐受机制。DRS还为RNA调控在生物胁迫响应中的作用提供了新的见解。来自拟南芥及苹果的研究表明，m⁶A修饰对于抗病原体至关重要，胁迫诱导的RNA修饰模式变化影响了防御相关转录本的表达及加工。值得注意的是，这些研究将RNA修饰状态与特定转录异构体及加工结果联系起来，表明表观转录组调控在超越基因水平表达的免疫响应中以分辨率更高的方式发挥微调作用。转座子（TEs）是植物基因组的一个决定性特征，通常在作物物种中占基因组含量的大部分。除了其在基因组进化及结构变异中的既定作用外，越来越多的证据表明TEs积极塑造转录组多样性及胁迫响应性。然而，解析TE衍生的转录调控长期以来一直具有挑战性，因为srRNA-seq难以解析TE相关转录异构体，这是由于序列重复性、模糊的读段定位及片段化的转录本重建。通过直接捕获跨越基因-TE连接点的全长天然RNA分子，DRS揭示了TEs如何被转录整合到宿主基因结构中。一个里程碑式的例子来自棉属（Gossypium），其基因组以大规模的TE扩张及频繁的多倍化为特征。研究人员证明，TEs在八个棉花物种中对转录后调控产生了广泛且系统性的影响。具体而言，发现TE相关异构体在相当比例的表达基因中普遍存在，拥有独特的TE衍生特征，包括替代性末端外显子