S1PR1（1-磷酸鞘氨醇受体1）信号通路人诱导多能干细胞来源心肌细胞分化和成熟

《Experimental & Molecular Medicine》：Sphingosine-1-phosphate receptor 1 signaling stimulates human pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte differentiation and maturation

　　

人心肌细胞相关体外模型的建立对于评估心脏毒性及药物疗效至关重要。尽管基于WNT（Wingless-related Integration Site，无翅相关整合位点）信号通路的方案已能实现多能干细胞向心肌细胞的分化，但存在分化效率低、表型不成熟以及不同细胞系间差异大等问题。本研究提出一种改良分化策略，可显著提高心肌细胞分化效率及功能成熟度，其人心脏组织功能特征具有可比性。尽管胎牛血清可增强分化，但研究发现1-磷酸鞘氨醇（S1P）与其受体S1PR1的相互作用是主要促进因素。基因分析、蛋白分析及多电极阵列电生理分析证实，利用S1P或其激动剂SEW2871激活S1PR1可增加自发性搏动心肌细胞的产生；而S1PR1缺陷人多能干细胞则表现出分化受损及S1P-S1PR1来源心肌细胞功能成熟度下降。此外，经S1P或SEW2871更强效分化处理后的心肌细胞移植后，左前降支结扎诱导的心肌梗死小鼠模型表现出心脏功能改善及纤维化减少。综上，S1PR1激活剂处理的心肌细胞为药物发现和再生医学提供了经济高效的平台。

## 研究背景与问题提出

心脏在循环系统中具有关键作用，负责将血液泵送至全身。由化疗药物或心血管疾病引起的心肌损伤直接关系到生死抉择，因此开发能够反映人体心脏结构与功能的体外心肌细胞模型已历经数十年的需求。由于人体心脏组织中缺乏可扩增的干细胞，原代心肌 cell无法用于培养，而具有分化为包括心肌 cell在内的所有细胞类型能力的人多能干细胞（human Pluripotent Stem Cell, hPSC）则被用于构建反映人心生理特性的预测模型。

尽管基于细胞信号通路和中胚层发育过程已提出多种心肌细胞分化方法，但在分化方案的稳定性、异种成分去除的化学限定培养基中提高细胞纯度等方面仍需改进。目前广泛使用的化学限定方法为Burridge等人建立的方案，该方案通过WNT信号通2.0d激活后再抑制其下游分子，诱导hPSC向中胚层谱系 cell分化。然而，该方案仍存在心肌细胞成熟度低、不同细胞系分化效率差异大等关键挑战。

既往研究表明，三维胚胎体短暂经胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）处理可提高分化效率，上调心肌细胞标志基因表达及功能特性。但三维心脏模型的复杂性、异质性及有限可扩展性限制了药物候选物的高通量筛选或治疗应用。相比之下，简单、经济且均质的二维心肌细胞分化方法虽具有高可靠性，但所得心肌细胞呈现不成熟表型且缺乏生理相关性。因此，开发具有更高成熟度和功能性的二维PSC来源心脏模型对于扩展未来应用至关重要。

FBS虽能增强PSC来源心肌细胞的分化效率，但存在批间差异、异种因素及成分不明确等局限，不利于转化药物测试。因此，本研究旨在阐明S1P信号及其与S1PR1相互作用在hPSC来源心肌细胞分化中的作用，以建立新型增强策略。S1P是一种通过G蛋白偶联S1P受体调节细胞行为的生物活性脂质介质信号分子，其中SphK1和SphK2参与S1P生物合成，在心脏发育、保护和再生中具有不同作用。S1P-S1PR1信号在心血管生理中的作用已明确，特别是在调节离子通道活性和收缩性方面，但其对心肌细胞分化和功能成熟的具体贡献尚不清楚。

## 主要技术方法

本研究采用三种hPSC系（H9 hESC系及CRL-2097、IMR90来源的hiPSC系），基于WNT信号通路调控的改良化学限定分化方案。分化第0-2天用6 μM CHIR99021诱导中胚层，随后2 μM Wnt-C59处理2天，之后转入心肌 cell维持培养基。实验组分别添加FBS、0.1 μM S1P、0.5 μM SEW2871或0.1 μM VPC23019。通过流式细胞术检测c租房态肌钙蛋白T（cardiac Troponin T, cTnT）评估分化效率；利用实时定量PCR和Western blot检测基因及蛋白表达；通过全基因组表达谱芯片分析转录组特征；采用多电极阵列（Multielectrode Array, MEA）记录场电位评估电生理功能；运用Seahorse XFp分析仪测定氧消耗率评估线粒体呼吸功能；通过CRISPR-Cas9基因编辑构建S1PR1敲除hiPSC系；利用磷酸激酶阵列筛选下游信号通路；最终在大鼠心肌梗死模型中通过超声心动图、Masson三色染色及免疫荧光评估治疗效果。

## 研究结果

### 血清促进不同hPSC系心肌细胞分化

通过改良WNT信号通路调控方法，四种hPSC系分化14天后均可见自发搏动区域及人心肌细胞特异性形态。流式结果显示FBS处理显著提高分化效率至>90% cTnT⁺细胞，且细胞系间差异小；而对照组效率低且变异性大（46.5-72.2%）。FBS处理组心肌细胞特异性转录因子GATA4、NKX2.5、HAND2表达在分化早期即显著上调，心房标志物（MYH6、MYL7）和心室标志物（MYL2、MYH7）基因表达亦显著上调。免疫荧光证实FBS处理组核NKX2.5及胞浆收缩标志物（MLC2a、MLC2v、cTnT）水平上调。MEA记录显示FBS处理组呈现更同步、更规则的场电位及搏动传播，表明形成更同步的细胞间网络。

### S1P通过S1PR1信号轴增强hPSC来源心肌细胞分化

芯片分析鉴定FBS中促进心肌细胞分化的关键成分。FBS处理组心肌细胞转录组在第15天即与成人心脏组织相似，而对照组需>30天。分析发现S1PR1是FBS处理显著上调的唯一膜结合受体基因，提示FBS作为S1PR1信号的上游激活因子。S1P作为血清成分及S1P受体天然配体，被认为是关键因子。功能验证显示，FBS处理、S1P处理及SEW2871处理组均出现扩大的自发搏动区，而对照组和VPC23019拮抗剂组仅见少量；FACS效率达90.1-93.7%，远高于VPC23019组（0.93%）。S1PR1激活组成熟心肌标志物基因表达显著更高，RNA测序显示其转录谱与人心脏样本高度相似，心脏肌肉收缩和传导相关基因显著富集。

### S1P-S1PR1信号介导hPSC来源心肌细胞形态和功能成熟

免疫荧光显示FBS、S1P或SEW2871处理组呈现 robust 的肌节α-辅肌动蛋白交叉网络，细胞面积、多核化比例和肌节长度均显著高于对照组。MEA结果显示S1PR1激活组场电位模式更规则，场电位持续时间（Field Potential Duration, FPD）378-455 ms更接近人心肌细胞；而对照组仅179 ms。S1PR1激活组场电位幅度更大，搏动传导规律同步。特异性离子通道抑制剂（E-4031、奎尼丁、维拉帕米）可干扰其电生理功能，与既往报道一致。Seahorse分析显示S1P处理组基础呼吸和ATP产生显著增加，偶联效率提高，非线粒体氧消耗降低，表明增强的线粒体功能和更成熟的代谢表型。与乳酸富集策略比较显示，S1PR1激活组在细胞成熟和功能方面更具优势。

### CRISPR-Cas9介导的S1PR1敲除抑制心肌细胞分化和功能整合

构建三个S1PR1敲除hiPSC克隆，确认外显子2缺失及S1PR1表达完全消除。S1PR1敲除hiPSC保持多能性特征，但向其分化14天后仅见少量搏动区域，cTnT⁺细胞比例降至19.4-43.3%，心肌标志物基因和蛋白表达显著降低，电生理分析显示不规则场电位和传播模式，功能低下。这些结果证实S1P-S1PR1信号通路对提高心肌细胞分化效率和质量具有关键作用。

### P38-MAPK信号作为S1P-S1PR1介导心肌细胞分化的下游效应器

磷酸激酶阵列分析发现P38和HSP27仅在野生型hiPSC来源心肌细胞中S1P处理后上调，而S1PR1敲除组无此现象。Western blot证实P38、ERK及HSP27磷酸化增加。利用P38激活剂茴香霉素（anisomycin）处理可成功挽救S1PR1敲除hiPSC的分化能力，效率达24.7%，与S1P联合处理进一步提升至56.0%，且心肌标志物蛋白及活化P38通路均上调。这些结果表明P38-MAPK信号通路是S1P-S1PR1相互作用下游增强心肌细胞分化的关键通路。

### S1P和SEW2871处理心肌细胞在心肌梗死后的治疗疗效

在LAD结扎诱导的心肌梗死大鼠模型中，S1P处理组和SEW2871处理组相比对照心肌细胞组显示出更优治疗效果。28天后超声心动图显示，S1P和SEW2871组左室收缩末期内径（Left Ventricular End-Systolic Dimension, LVESD）降低、缩短分数（Fractional Shortening, FS）增加更显著，S1P组左室舒张末期内径（Left Ventricular End-Diastolic Dimension, LVEDD）亦有显著改善。Masson三色染色显示S1P和SEW2871组纤维化显著减少、左室壁厚度得以保持；cTnT和人核抗原（Human Nuclear Antigen, HNA）共免疫荧光显示移植细胞在心肌中的植入率更高。这些发现表明S1PR1激活剂成熟化的心肌细胞具有增强的植入能力和更优的心脏功能结构恢复。

## 讨论与结论总结

随着干细胞分化和发育研究的进展，PSC来源心肌细胞的生成方案已被广泛研究以应用于心脏疾病建模、药物毒性评估和再生治疗。然而，hPSC来源心肌细胞成熟度及功能性处于胎儿样水平等问题常限制其应用。本研究确定S1PR1信号是化学限定条件下增强hPSC来源心肌细胞分化效率和功能成熟的关键调节因子。

FBS虽广泛用于增强心肌细胞分化，但其成分不确定和异种属性等因素使其不适用于限定培养方法和临床应用。本研究确认S1P-S1PR1相互作用是促进hPSC来源心肌细胞分化的关键因素。激活S1PR1信号通路可显著提高分化效率和功能成熟度，所得细胞在基因表达模式上与成人心脏组织高度相似，呈现规律同步的电生理特性。考虑到hPSC来源心肌细胞在心脏治疗、药物筛选和疾病模型中的应用主要受限于不成熟表型，该方法通过激活S1P-S1PR1相互作用获得高产量、更成熟的功能性hPSC来源心肌细胞，为未来基于心脏细胞的技术提供了新思路。

S1PR1敲除hiPSC研究进一步确认了S1PR1的核心作用，与既往S1PR1或Sphk敲除小鼠血管发育缺陷及胚胎致死性研究一致。p38-MAPK通路作为S1PR1下游关键信号，其激活可挽救S1PR1敲除细胞的分化缺陷，该通路在胎盘血管生成、血管重塑及心脏发生中的重要作用已被报道，本研究结果进一步验证了其显著角色。

在心肌梗死模型中，S1PR1激活剂处理的心肌细胞表现出优于对照细胞的疗效，包括改善FS、减少心肌纤维化和减薄弱左室壁变薄，这与其增强的植入能力密切相关。尽管该模型依赖药物免疫抑制且观察期限于4周，但结果提示S1PR1激活剂介导的心肌细胞成熟化为临床应用带来希望。结合生物材料方法可能进一步加速移植前后心肌细胞成熟并提高植入效率。

本研究提出了一种新型无动物成分的化学限定方法，通过S1PR1激活剂处理获得高纯度、高成熟度的hPSC来源心肌细胞。该方法克服了既往方案中不成熟表型、低纯度和低功能性的局限，为药物发现和再生医学研究提供了更先进、经济高效的应用平台。此外，S1PR1在心脏发育中的重要性及其与左室致密化不全型心肌病等心脏疾病的关联，有望为复杂心脏发育及疾病发生机制的阐明做出贡献。