ISGylation介导的CYP4Z1稳定化驱动乳腺癌起始与进展

《Experimental & Molecular Medicine》：ISGylation-mediated stabilization of CYP4Z1 fuels breast cancer initiation and progression

　　

肿瘤起始细胞（tumor-initiating cells，TICs）是癌症进展和转移的核心驱动因素；然而，这类细胞在治疗上仍然难以被有效靶向。研究人员利用乳腺特异性CYP4Z1转基因MMTV-PyMT小鼠模型证明，CYP4Z1可显著加速肿瘤起始、增大肿瘤体积、促进转移并扩增TIC群体。多组学（multi-omics）分析显示，与CYP4Z1^?对应细胞相比，CYP4Z1⁺上皮细胞表现出更强的干性（stemness）及更低的分化程度。值得注意的是，ISG15介导的CYP4Z1在赖氨酸残基K259、K279和K502位点发生ISGylation修饰，可稳定该蛋白、增强其酶学功能、促进其向内质网（endoplasmic reticulum，ER）定位并抑制其泛素化（ubiquitination），从而放大TIC样特征。该修饰还进一步上调甘油三酯（triglyceride，TAG）合成并促进脂滴形成。最后，研究人员开发了CYP4Z1特异性抑制剂BM-51，该化合物可削弱TIC样特征并增强化疗疗效。上述发现强调了靶向CYP4Z1及其ISGylation修饰以阻断TIC驱动的乳腺癌进展的治疗潜力。

CYP4Z1的ISGylation受ISGylation相关酶调控，包括E1酶UBE1L、E2酶UBCH8、E3酶Herc5，以及去ISGylation酶USP18。CYP4Z1的ISGylation通过两种关键方式增强CYP4Z1的致瘤特性。其一，CYP4Z1的ISGylation抑制其泛素化及降解，导致CYP4Z1蛋白水平升高。其二，CYP4Z1的ISGylation促进CYP4Z1向内质网（ER）转位，进而推动下游TAG合成及脂滴形成。这些过程共同促进肿瘤起始、转移和化疗耐受。针对CYP4Z1专门设计的抑制剂BM-51可通过抑制其酶活性，对抗CYP4Z1的促肿瘤效应。TAG，甘油三酯；UB，泛素。

该研究发表于《Experimental 》，围绕乳腺癌中肿瘤起始细胞（tumor-initiating cells，TICs）的关键驱动机制展开，聚焦细胞色素P450家族成员CYP4Z1在肿瘤发生、进展和转移中的作用，并进一步解析其翻译后修饰（post-translational modification，PTM）机制及药物干预潜力。乳腺癌目前已成为全球最常见恶性肿瘤之一，尽管治疗手段持续进步，但原发或继发耐药、肿瘤复发以及远处转移仍是限制疗效的核心问题。既往研究提示，TICs兼具自我更新、分化塑性和耐药性，是驱动肿瘤持续进展的重要细胞群体；然而，针对TICs的靶向治疗始终面临特异性不足和有效靶点不明确的问题。因此，鉴定促进乳腺TIC形成与维持的关键驱动基因，并据此开发高选择性抑制策略，具有重要理论与转化价值。

在这一背景下，研究人员首先基于MMTV-PyMT乳腺癌模型构建了乳腺特异性表达人体CYP4Z1的转基因小鼠，并将其与PyMT模型杂交，系统评估CYP4Z1在体内乳腺肿瘤发生发展中的生物学功能。结果表明，CYP4Z1并非单纯相关分子，而是具有明确促癌效应：其敲入可显著提前肿瘤触及时间，增加肿瘤数目、体积与重量，并显著促进肺和肝转移。更重要的是，CYP4Z1可促进PyMT诱导的TIC群体扩增，不仅增强肿瘤起始能力，还维持已形成肿瘤中的TIC功能。研究同时显示，CYP4Z1驱动的肿瘤呈现更低分化状态和更强侵袭性，提示其可能通过增强干性和抑制分化来塑造恶性表型。

为解析分子机制，研究人员进一步整合单细胞转录组、空间转录组、TCGA-BRCA队列分析和蛋白互作组学等多层证据。结果显示，CYP4Z1主要富集于乳腺癌上皮细胞群，且CYP4Z1⁺上皮细胞较CYP4Z1^?群体表现出更高干性、更低分化程度，并伴随缺氧（hypoxia）、上皮-间质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）、糖酵解、JAK-STAT3及转化生长因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-beta）等促肿瘤通路上调。空间分析进一步提示，CYP4Z1⁺上皮细胞更多位于肿瘤边缘区域，与侵袭前沿特征一致。TCGA去卷积分析则显示，高CYP4Z1表达及高CYP4Z1⁺上皮细胞比例与更高基质成分、更低肿瘤纯度以及更强ECM、EMT和干性通路活性相关，进一步支持CYP4Z1与肿瘤去分化、侵袭转移表型密切相关。

在机制层面，本研究的重要创新之一是揭示了CYP4Z1的ISGylation调控。研究人员通过共免疫沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP）结合互作蛋白质组学筛选发现，泛素样蛋白ISG15是与CYP4Z1互作评分最高的PTM相关分子。随后证实，ISG15可直接介导CYP4Z1发生ISGylation，且这一过程受UBE1L、UBCH8、Herc5和USP18等ISGylation相关酶调节。通过修饰位点蛋白质组学与定点突变分析，研究人员确定K259、K279和K502是CYP4Z1发生ISGylation的关键位点。功能上，ISGylation一方面抑制CYP4Z1的泛素化和蛋白降解，从而提高其稳定性；另一方面促进CYP4Z1向内质网（ER）定位并增强其酶活性。上述效应共同增强CYP4Z1介导的TIC样特征，包括CD44⁺/CD24^?群体增加、干性标志物KLF4、Sox2、ALDH1A1升高、乳球形成能力增强以及迁移侵袭增强。相比之下，K259R/K279R/K502R突变显著削弱这些作用，并在体内限制稀释移植和尾静脉转移模型中表现为肿瘤起始和转移能力下降，说明CYP4Z1的促癌功能高度依赖其ISGylation状态。

研究方法方面，作者主要采用以下关键技术路线：构建乳腺特异性CYP4Z1转基因并与MMTV-PyMT杂交的小鼠模型评估体内肿瘤起始、增长、转移及TIC扩增；结合单细胞RNA测序数据集GSE225600、空间转录组数据集GSE213688及TCGA-BRCA队列开展多组学整合分析；采用co-IP、互作蛋白质组学、ISGylation位点鉴定和定点突变明确CYP4Z1的修饰机制；通过流式细胞术、乳球形成、限制性稀释移植、尾静脉转移、脂质组学、BODIPY脂滴检测、酶活测定、CETSA、DARTS、分子对接及分子动力学等手段验证功能与药物靶向关系。

在代谢层面，研究进一步将CYP4Z1的功能与脂质代谢重编程联系起来。脂质组学分析表明，无论过表达CYP4Z1还是ISG15，差异脂质中最突出变化均指向甘油三酯（TAG）家族上调，而部分心磷脂（cardiolipin）下调。由于内质网是脂滴形成中心，且TAG是脂滴主要组成成分之一，研究人员进一步证实，CYP4Z1及其ISGylation可显著促进脂滴形成，而K259R/K279R/K502R突变则削弱该效应。更关键的是，抑制TAG生成可逆转CYP4Z1诱导的干性标志物上调、CD44⁺/CD24^?比例增加和迁移能力增强，而外源补充TAG可部分恢复CYP4Z1敲低导致的TIC样表型下降。这一结果表明，CYP4Z1的ISGylation通过增强TAG合成和脂滴生物发生，建立有利于TIC维持的代谢环境，是连接酶活调控与肿瘤干性的关键桥梁。

围绕靶向干预，研究人员在既往先导化合物1-Ben基础上设计并合成了一系列新型1-benzylimidazole类似物，从53个候选分子中筛选得到高效高选择性CYP4Z1抑制剂BM-51。BM-51对CYP4Z1的IC50为91.7 nM，对CYP4同工酶具有>100倍选择性，并具有较理想药代动力学性质。结构与生化证据显示，BM-51主要结合CYP4Z1的Arg384、Ser383、Val126和Ala314位点。功能上，BM-51可抑制CYP4Z1驱动的乳腺癌TIC样特征，在4T1补救模型、异种移植模型及PyMT-CYP4Z1小鼠中均表现出抑制肿瘤起始、降低肿瘤负荷和减少肺转移的作用。尤其值得注意的是，BM-51对PyMT-MMTV对照小鼠肿瘤起始影响较小，但可显著延缓PyMT-CYP4Z1小鼠肿瘤发生，提示其作用具有较强靶向依赖性。此外，BM-51还能增强阿霉素（Adriamycin）的抑瘤效果，并降低肿瘤中干性标志物表达，显示出改善化疗敏感性的潜力。安全性方面，BM-51对正常乳腺发育、造血干/祖细胞群体及外周血细胞计数未见明显不良影响，提示其具有一定应用前景。

以下按结果小标题概括主要发现。
第一部分“Knock-in of CYP4Z1 promotes the formation and metastasis of PyMT-induced mammary tumor and increases the expansion of PyMT-induced TICs”显示：通过PyMT-CYP4Z1转基因小鼠模型、乳腺全片染色、流式分选和限制性稀释移植，研究证实CYP4Z1可促进乳腺肿瘤更早发生、更快生长并增强远处转移，同时扩增CD29^loCD24⁺及CD29^loCD24⁺ALDH⁺等TIC相关群体，提升肿瘤起始频率。
第二部分“Knock-in of CYP4Z1 exhibits a decreased differentiated status and enhances cell invasion phenotype”显示：通过组织学、qRT-PCR、单细胞/空间转录组和TCGA分析，研究证明CYP4Z1促使肿瘤分化标志物下调、侵袭前沿K14⁺细胞富集，并使CYP4Z1⁺上皮细胞呈现更高干性、更低分化和更强EMT/ECM相关活性。
第三部分“ISG15 can directly bind to and induce the ISGylation of CYP4Z1 at K259, K279, and K502”显示：通过co-IP、蛋白互作组学、内源及外源ISGylation检测、位点蛋白质组学和突变验证，研究确定ISG15可直接介导CYP4Z1在K259、K279和K502位点发生ISGylation，并抑制其泛素化降解。
第四部分“CYP4Z1 enhances the TIC-like traits of breast cancer cells dependent on its ISGylation”显示：通过ISG15干预、关键位点突变、流式、乳球形成、体内限制稀释和转移实验，研究证明CYP4Z1增强TIC样特征依赖其ISGylation，关键位点突变可显著削弱其促干性和促转移作用。
第五部分“The ISGylation of CYP4Z1 facilitates its enzyme activity and subcellular localization in endoplasmic reticulum (ER)”显示：通过酶活测定和免疫荧光共定位分析，研究发现ISGylation提高CYP4Z1酶活，并促进其向ER定位，从而为下游代谢重编程提供基础。
第六部分“The ISGylation of CYP4Z1 promotes the TIC-like traits of breast cancer cells by enhancing TAG production and subsequent formation of lipid droplets”显示：通过脂质组学、脂滴检测及代谢补救实验，研究表明CYP4Z1及其ISGylation促进TAG生成和脂滴形成，且该代谢改变是其维持乳腺癌TIC样状态的重要机制。
第七部分“Discovery of a potent CYP4Z1 inhibitor BM-51 that attenuates the TIC-like traits of breast cancer cells”显示：通过药物设计筛选、酶活抑制、分子对接、分子动力学、CETSA、DARTS和功能实验证实，BM-51是高效高选择性的CYP4Z1抑制剂，可直接结合关键位点并抑制其促TIC作用。
第八部分“Compound BM-51 suppresses the progression and the function of PyMT-induced TICs in PyMT-CYP4Z1-KI mice and chemosensitivity of breast cancer cells”显示：通过PyMT-CYP4Z1小鼠治疗、异种移植和联合化疗实验，研究证明BM-51可抑制CYP4Z1依赖的肿瘤起始、增长、转移及TIC扩增，并增强阿霉素化疗效果。

讨论部分指出，本研究从体内遗传模型、多组学分析、蛋白修饰机制、代谢重编程和药物研发多个层面，系统建立了CYP4Z1驱动乳腺癌恶性进展的因果链条。CYP4Z1不仅促进TIC扩增和维持，还推动肿瘤去分化和侵袭性增强；而ISG15介导的ISGylation是其发挥稳定化和功能增强作用的关键环节。研究同时提示，CYP4Z1诱导的TAG与脂滴积累并非单纯代谢伴随现象，而可能是支持癌症干性维持的重要功能模块。BM-51作为独立于ISGylation位点之外、直接抑制CYP4Z1催化活性的药理工具，为后续靶向TIC的精准治疗提供了新路径。作者同时指出，不同乳腺癌亚型间可能存在异质性，未来仍需开展分层研究以推进临床转化。

研究结论部分可译为：
总之，CYP4Z1通过增强TIC样特征、促进去分化和侵袭性表型以及重编程脂质代谢来推动乳腺癌进展。ISG15介导的CYP4Z1 ISGylation对其功能至关重要，因此为治疗干预提供了潜在靶点。这些发现凸显了CYP4Z1在乳腺癌中的多重作用，并表明其有望成为阻止肿瘤进展与转移的治疗靶标。