人脐带血造血干祖细胞中嘌呤能信号的单细胞架构

《Leukemia》：Single-cell architecture of purinergic signaling in human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells

　　

嘌呤能信号（purinergic signaling）已成为造血干祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cell, HSPC）迁移、代谢及先天免疫应答的关键调控因子。研究人员此前证实，胞外ATP（extracellular ATP, eATP）通过激活P2X嘌呤能受体并下游激活Nlrp3炎性小体促进HSPC mobilization、homing及engraftment，而ATP向胞外腺苷的酶促转化则产生相反的抗炎效应。随后，研究人员提出嘌呤能信号是进化上古老的调控系统，内在嵌合于造血干细胞程序中。然而，其在不同人HSPC亚群中的转录组组织方式尚不清楚。研究人员应用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）分析人脐血来源的CD133⁺Lin^-CD45⁺及CD34⁺Lin^-CD45⁺富集HSPC。鉴定出代表原始祖细胞及谱系定向中间态的转录异质性cluster，并证实这些群体中嘌呤能受体及核苷酸代谢酶的层级组织。原始HSPCs表现出受限的嘌呤能受体库伴随胞内核苷酸回收机制，与严格调控的代谢-免疫状态一致。谱系偏倚cluster显示与炎症激活、迁移及命运决定相关的受体及外切核苷酸酶选择性富集。这些发现共同确立嘌呤能信号为早期造血的根本性、细胞内在调控因子，并揭示这一古老信号通路如何塑造人干细胞命运决定。

## 研究背景与问题提出

嘌呤能信号是进化上保守的细胞间通讯系统，调控炎症、免疫、代谢及干细胞行为。在造血系统中，胞外核苷酸如ATP及其代谢物通过七类离子型P2X受体、八类G蛋白偶联P2Y受体及四类腺苷激活的P1受体调控HSPC静息、激活、迁移及谱系启动。胞外配体的可利用性由ectonucleotidases（包括CD39及CD73）以及胞内腺苷回收或降解酶严格调控，从而塑造骨髓微环境中的局部嘌呤能张力。过去二十年间，研究人员系统证实嘌呤能信号是调控HSPC迁移的关键调控轴：eATP通过激活P2X1、P2X4及P2X7等嘌呤能受体促进HSPC mobilization、homing及engraftment，且这些效应依赖于胞内Nlrp3炎性小体的激活；同时，CD39和CD73 ectonucleotidases将eATP酶促转化为胞外腺苷，通过A2B腺苷受体诱导血红素加氧酶1（heme oxygenase-1, HO-1）从而抑制Nlrp3炎性小体活性，形成反向调控通路。基于此，研究人员提出嘌呤能信号与先天免疫是进化上古老、代谢偶联的系统，内嵌于造血干细胞中调控其命运决定、应激响应及与骨髓微环境的相互作用。然而，尽管功能研究丰富，嘌呤能信号各组分在不同转录状态人HSPC亚群中的表达模式，尤其在最早造血发育阶段的分布，仍属未知。既往研究主要依赖bulk转录组和功能实验，掩盖了HSPC群体的细胞异质性。因此，研究人员亟待在单细胞分辨率下解析嘌呤能信号的空间分布特征。

## 研究设计与方法

样本来源为华沙医科大学妇产科收集的健康足月新生儿脐带血。研究人员分离CD133⁺Lin^-CD45⁺和CD34⁺Lin^-CD45⁺两种免疫表型 distinct 的HSPC群体，前者代表更原始的干细胞样状态，后者涵盖更广泛且异质性更强的祖细胞群体。单细胞文库经Illumina NextSeq 1000/2000测序，使用10x Genomics Cell Ranger流程处理。质量控制后保留3 602个CD133⁺细胞和4 811个CD34⁺细胞，采用Seurat包进行降维、聚类及可视化分析。通过Wilcoxon秩和检验鉴定cluster特异性标记基因，并进行Reactome和Gene Ontology功能注释，以解析嘌呤能受体和核苷酸代谢酶的表达模式。

## 研究结果

**单细胞转录组分析鉴定原始及谱系定向HSPC亚群**

scRNA-seq分析显示，CD133⁺Lin^-CD45⁺和CD34⁺Lin^-CD45⁺细胞均存在多个转录异质性cluster，对应原始祖细胞和谱系定向中间态。统一流形逼近与投影（Uniform Manifold Approximation and Projection, UMAP）分析揭示早期造血的固有多样性。Cluster注释证实存在多能祖细胞、早期谱系偏倚状态，以及定向髓系、淋巴系、红系和巨核系的细胞。在CD133⁺数据中，部分cluster高表达CD133、CD34及KIT（c-Kit）等干性相关标记， lineage限制性基因低表达，符合原始祖细胞身份；其余cluster显示向单核细胞（CD14、CD68）、T细胞（CD2、CD3、CD4）、NK细胞（CD16）、B细胞（CD19、CD22）、红细胞（GYPA）及巨核细胞（ITGA2B/CD41）定向的转录特征。CD34⁺群体呈现类似的层级组织，原始cluster表达代谢和发育通路，谱系定向cluster则富集先天免疫、适应性免疫及红系-巨核系分化特征。

**嘌呤能受体表达在HSPC亚群中呈层级组织**

研究人员系统检测了P1（ADORA）、P2X和P2Y嘌呤能受体基因的表达。结果显示，嘌呤能受体表达高度结构化且非均一：原始祖细胞维持保守的核心受体库，谱系定向cluster则呈现逐渐多样化的受体景观。原始HSPC cluster一致表达受限的嘌呤能受体组，主要包括P2RX1、P2RX4、P2RX7及ADORA2A和ADORA2B，提示与代谢调控和免疫监视相关的基础嘌呤能信号状态，而非明显的炎症激活。相反，谱系偏倚cluster选择性富集与炎症信号、趋化及应激响应相关的受体，包括P2RY11、P2RY13和P2RY14。某些受体呈现显著谱系特异性：P2RX5在B细胞相关cluster中选择性富集，P2RY12局限于血小板相关cluster，与其在免疫和巨核生物学中的已知功能一致。重要的是，嘌呤能受体表达模式与转录状态和谱系定向程度而非CD133或CD34免疫表型本身关联，表明嘌呤能信号架构主要由分化状态决定。

**造血分化过程中嘌呤能调控酶的动态重塑**

研究人员进一步分析了调控胞外核苷酸代谢的酶类表达，包括ectonucleotidases、腺苷代谢酶及胞内核苷酸回收组分。酶表达模式呈现清晰的状态依赖性和谱系依赖性组织，与嘌呤能受体的层级分布镜像对应。原始HSPC cluster优先表达参与胞内核苷酸回收和线粒体ATP产生的酶，包括腺苷激酶（adenosine kinase, ADK）和ATP合酶亚基，符合代谢调控的嘌呤能 state。相反，谱系定向cluster选择性富集ectonucleotidases如ENTPD1（CD39）和NT5E（CD73），提示在分化过程中逐步获得胞外ATP降解和腺苷生成能力。腺苷降解酶如腺苷脱氨酶（adenosine deaminase, ADA）在原始和谱系偏倚群体中均有检出，表明腺苷可用性的严格调控是早期造血的普遍特征。ENPP家族成员显示cluster限制性表达，指示特定祖细胞状态中核苷酸代谢的专门化作用。

**功能注释将嘌呤能架构与造血层级关联**

基于Reactome和Gene Ontology的功能注释进一步支持HSPC的层级组织。原始cluster富集发育、增殖、翻译和代谢通路，谱系偏倚cluster则关联先天免疫应答、适应性免疫、红系分化或巨核系程序。值得注意的是，cluster的功能分层与嘌呤能受体和酶表达的组织紧密平行，表明转录状态、谱系定向与嘌呤能信号配置之间存在协调关系。原始祖细胞将发育和代谢程序与受限的嘌呤能受体库结合，而命运决定cluster则整合免疫和谱系特异性通路与扩展的嘌呤能信号能力。

**早期人造血中嘌呤能信号的整合视角**

综合结果表明，嘌呤能信号组分在人HSPC群体中并非均一分布，而呈现层级性、亚群特异性组织。原始祖细胞维持与代谢调控和免疫监视关联的受限嘌呤能程序，谱系定向cluster逐步获得使能炎症应答、趋化和命运决定的受体和酶配置。这一单细胞框架为先前观察到的嘌呤能信号对HSPC迁移和功能的上下文依赖性效应提供了机制基础。该层级组织在独立纯化的CD133⁺Lin^-CD45⁺和CD34⁺Lin^-CD45⁺群体中均一致观察到，表明分化状态而非免疫表型选择主导嘌呤能架构。

## 讨论与结论

本研究的单细胞分析为既往功能研究提供了机制背景。先前体内外实验显示P2X1、P2X4或P2X7受体基因缺陷或药理学抑制损害HSPC mobilization、homing和engraftment，且依赖Nlrp3炎性小体；但未能确定这些受体在HSPC群体中的分布特征。单细胞数据表明嘌呤能信号呈层级组织：最原始CD133⁺和CD34⁺祖细胞优先表达有限的嘌呤能受体库及胞内核苷酸回收酶，符合严格调控的代谢和免疫监视状态；谱系定向和命运决定cluster则选择性富集与炎症激活、趋化和迁移相关的受体及ectonucleotidases，为嘌呤能信号扰动产生强功能效应尽管 bulk 基因表达变化相对温和提供了细胞层面的解释。

研究人员进一步指出，这些发现与既往观察一致——胞外腺苷通过A2B受体及抑制Nlrp3炎性小体发挥HSPC迁移负调控作用。 原始HSPC cluster虽ectonucleotidases表达有限，但保留腺苷受体（A2A和A2B）表达，这可能反映原始HSPC对邻位生态位细胞产生胞外腺苷的依赖性，以及循环腺苷和应激诱导ectonucleotidases表达的替代配体来源。NT5E（CD73）转录本在原始cluster中虽 modest，但其表达受微环境信号和炎症信号动态调控，稳态脐带血转录水平未必反映mobilization或应激条件下的蛋白丰度或可诱导活性。

研究结果进一步支持嘌呤能信号与先天免疫在早期造血中形成整合调控网络的新兴概念。研究人员近期关于胞内补体（complosome）的工作表明，胞内补体激活在原始HSPCs中作为代谢和免疫调控模块运作；本研究将此框架扩展至单细胞分辨率下嘌呤能信号组分同样内嵌于原始人HSPCs中。这些发现指示，进化上古老的危险感知通路并非外围调节因子，而是造血干细胞程序的根本组成部分。尚待研究的问题是嘌呤能信号是否类似complosome以自分泌或内在方式调控细胞命运，通过与线粒体或线粒体相关膜（mitochondria-associated membranes, MAMs）上的胞内嘌呤能受体相互作用。

本研究的局限性在于仅依赖转录组数据，不能直接捕获受体蛋白丰度或功能活性。因此，观察到的表达模式应被解读为潜在功能状态的指示，而非受体活性的直接证据。尽管发现得到研究团队大量先前功能工作的强支持，未来需整合单细胞蛋白质组学或功能扰动方法以直接验证蛋白水平的受体活性。

重要的是，此处定义的转录构架可作为理解白血病中嘌呤能失调的参考。白血病干细胞已被证实利用嘌呤能信号通路，包括升高的胞外ATP水平、异常P2X7受体激活及增加的ectonucleotidase活性导致腺苷介导的免疫抑制。正常HSPCs中观察到的层级组织提示，恶性转化可能涉及这些通路的选择性调制或重连，从而促进生态位重塑、免疫逃逸和治疗抵抗。

**研究结论**

本研究首次提供了人HSPCs原始和谱系偏倚状态中嘌呤能受体和核苷酸代谢酶的单细胞分辨率图谱。通过整合这些数据与既往功能数据和概念工作，研究人员证明嘌呤能信号不仅是炎症通路，更是早期造血发育的核心调控因子。这些发现将嘌呤能信号定位为干细胞调控网络的基本组成部分，并建立细胞框架以理解代谢和先天免疫信号如何塑造人造血。该研究对优化依赖调节嘌呤能和先天免疫信号通路的干细胞动员和移植策略具有潜在意义，亦有助于深入理解嘌呤能信号发挥重要作用的白血病发病机制。该论文发表在《Leukemia》。