TNFRSF18+ 调节性T细胞作为免疫抑制型结肠癌免疫治疗结果的潜在生物标志物

《HUMAN MUTATION》：TNFRSF18+ Regulatory T Cells as a Potential Biomarker of Immunotherapeutic Outcomes in Immunosuppressed Colon Cancer

　　

识别可靠的生物标志物以对结肠癌（Colon Cancer, CC）患者进行免疫治疗分层，由于肿瘤微环境的免疫抑制特性，仍然是一个关键的未满足的临床需求。本研究利用癌症基因组图谱-结肠腺癌（TCGA-COAD）转录组数据，通过单样本基因集富集分析（single-sample Gene Set Enrichment Analysis, ssGSEA）将患者分类为免疫高和免疫低表型，发现免疫低亚组表现出显著更差的生存率（p = 0.038）。在该队列中，肿瘤坏死因子受体超家族成员18（TNFRSF18）的高表达被确定为预后不良的关键标志物（p = 0.030）。单细胞核糖核酸测序（single-cell RNA sequencing）确定TNFRSF18表达主要位于调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）上。在一个独立的免疫治疗队列中的进一步验证显示，TNFRSF18⁺ Tregs的高浸润与较短的无病生存期（Disease-Free Survival, DFS）和总生存期（Overall Survival, OS）显著相关（p = 0.041 和 p = 0.007）。功能性体外类器官实验表明，TNFRSF18低表达的肿瘤对抗程序性细胞死亡蛋白1（anti-Programmed Cell Death Protein 1, anti-PD-1）治疗敏感，其特征是干扰素-γ（Interferon-γ, IFN-γ）和颗粒酶B（Granzyme B, GZMB）分泌增加，而TNFRSF18高表达的肿瘤则表现出治疗抵抗。总之，本研究确立了TNFRSF18⁺ Tregs作为一种新型的预后标志物和免疫抑制型结肠癌免疫治疗反应的预测因子，表明靶向TNFRSF18可能潜在地增强抗PD-1疗法在耐药患者亚群中的疗效。

**论文解读：TNFRSF18⁺调节性T细胞作为免疫抑制型结肠癌免疫治疗反应的预测性生物标志物**

**研究背景与问题**
结肠癌（Colon Cancer, CC）是全球范围内第三大常见诊断的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因。以免疫检查点抑制剂为代表的免疫疗法为一部分结肠癌患者带来了希望。然而，目前的临床证据表明，仅有约5%的具有高度微卫星不稳定性（Microsatellite Instability-High, MSI-H）的患者能从免疫检查点阻断中显著获益。即使在微卫星稳定（Microsatellite Stable, MSS）的患者群体中，也仅有一个特定亚组可能对免疫治疗有反应，这种差异很大程度上归因于肿瘤免疫微环境（Tumor Immune Microenvironment）的异质性。这种异质性凸显了发现稳健的生物标志物，以识别可能对免疫疗法有反应的免疫抑制型结肠癌患者的迫切临床需求。肿瘤微环境中的调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）是负责免疫抑制的淋巴细胞亚群，其存在常通过抑制抗肿瘤免疫与肿瘤进展相关。细胞表面受体TNFRSF18（肿瘤坏死因子受体超家族成员18）被确定为主要在Tregs上表达的免疫检查点分子，但其在结肠癌发病机制和治疗中的作用尚不明确。因此，研究人员旨在探索TNFRSF18⁺ Tregs在结肠癌，特别是免疫抑制亚型中的预后价值和免疫治疗预测潜力。该研究发表于《HUMAN MUTATION》期刊。

**关键技术方法**
为开展研究，研究人员整合运用了多种生物信息学分析与实验验证技术。首先，利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）的结肠腺癌（COAD）队列转录组数据，通过单样本基因集富集分析（ssGSEA）对患者进行基于免疫特征的亚型分类。其次，借助公共基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）的单细胞核糖核酸测序（scRNA-seq）数据，解析了TNFRSF18在肿瘤微环境中的细胞来源。此外，研究还纳入了来自浙江大学附属金华医院的40例接受免疫治疗的MSS型结肠癌患者队列（样本队列来源），通过多重免疫荧光染色等技术验证临床相关性。最后，研究人员建立了患者来源的类器官（Patient-Derived Organoids）与自体外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的共培养体系，用以在体外功能性地评估肿瘤对PD-1阻断剂的反应性。

**研究结果**
**3.1. 结肠癌的免疫分层与肿瘤微环境**
通过对TCGA-COAD转录组谱进行ssGSEA分析，研究人员将患者分层为免疫高和免疫低两个亚型。生存分析显示，免疫高亚组患者的总生存期显著优于免疫低亚组。进一步分析表明，免疫高亚组具有更高的免疫细胞浸润水平和肿瘤突变负荷（Tumor Mutational Burden, TMB）。

**3.2. 免疫低亚组内的预后意义**
鉴于免疫低亚组生存结局不佳，研究人员聚焦于该亚组进行生存分析。研究发现，免疫检查点基因TNFRSF18的高表达是该亚组患者预后不良的显著负性因素。在CMS2（共识分子亚型2）分类的免疫荒漠型患者中也验证了类似趋势。

**3.3. TNFRSF18在免疫抑制型结肠癌中的细胞来源**
通过分析单细胞转录组数据，研究人员发现TNFRSF18的表达主要定位在CD4⁺ T细胞区室。进一步的亚群分析明确证实，调节性T细胞是TNFRSF18的主要表达者。

**3.4. TNFRSF18⁺ Tregs浸润预测免疫治疗反应**
在40例接受免疫治疗的MSS结肠癌患者队列中，通过多重免疫荧光染色评估TNFRSF18⁺ Tregs的肿瘤浸润。分析显示，高浸润组患者的原发肿瘤体积更大，且其无病生存期和总生存期均显著缩短。多因素Cox回归分析证实，高TNFRSF18⁺ Tregs浸润是总生存期受损的独立风险因素。

**3.5. hdWGCNA识别TNFRSF18⁺ Tregs内不同的共表达程序**
应用高维加权基因共表达网络分析（high-dimensional Weighted Gene Co-expression Network Analysis, hdWGCNA）揭示了TNFRSF18⁺ Tregs内部存在九个基因共表达模块，表明该细胞亚群具有显著的转录异质性。功能富集分析显示这些模块与蛋白质翻译、抗原加工与呈递、细胞骨架调节、表观遗传调控和线粒体相关过程等多种生物学功能相关。

**3.6. TNFRSF18⁺ Tregs特征基因集的批量转录组投射揭示结肠癌的独特突变特征**
基于单细胞数据构建的TNFRSF18⁺ Tregs特征基因集被投射到TCGA-COAD批量转录组数据中。分析发现，高TNFRSF18⁺ Tregs特征评分组的肿瘤具有更高的肿瘤突变负荷和更广泛的突变谱，显示出与低评分组不同的基因组景观和基因对互作模式。

**3.7. 基于TNFRSF18⁺ Tregs状态对PD-1阻断的不同反应**
通过患者来源类器官与自体PBMCs共培养体系的功能实验，研究人员评估了肿瘤对PD-1阻断剂的敏感性。结果显示，来自TNFRSF18低表达组的类器官在抗PD-1抗体处理后出现明显的结构崩解和细胞死亡，并伴随IFN-γ和GZMB分泌的显著增加。而TNFRSF18高表达组的类器官则保持结构完整，对抗PD-1治疗无显著反应。

**讨论与结论总结**
免疫抑制型结肠癌对免疫疗法的有限反应性是其临床管理中的持续挑战。本研究通过ssGSEA进行免疫亚型分型，发现TNFRSF18⁺ Tregs的高浸润与结肠癌免疫治疗效果不佳相关。尽管在多变量分析中，其对无病生存期的预测未达到统计学显著性，但其对总生存期是一个显著的预测因子，这可能与免疫治疗的“长尾效应”有关。从生物学角度看，TNFRSF18⁺ Tregs并非转录同质的群体，而是包含多个与免疫调节、生物合成和代谢程序相关的共表达模块，表明其可能是一个功能活跃且适应性强的免疫调节群体。此外，富含TNFRSF18⁺ Tregs特征的肿瘤表现出更高的突变负荷和独特的基因组结构，提示基因组不稳定性可能与促进该Treg亚群的微环境有关。研究承认存在一些局限性，包括缺乏体内转基因动物模型验证、检测方法非全自动化可能引入主观偏倚，以及用于定义TNFRSF18⁺ Tregs高浸润的阈值是在较小队列中通过数据驱动方法确定的，需要在更大独立队列中进行验证。

**研究结论翻译如下：**
总之，我们的研究结果首次提供了证据，表明TNFRSF18⁺ Tregs可以作为免疫抑制型结肠癌的预后指标和免疫治疗反应的预测因子。此外，TNFRSF18激动剂有望在提高该患者亚群抗PD-1治疗的有效性方面发挥重要作用。