《Cell Proliferation》：Periodontitis-Associated Circulating EVs Promote Colorectal Cancer Progression via Carnosine-Mediated Acidosis Adaptation
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摘要：结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤。流行病学研究表明牙周炎（Periodontitis, PD）与CRC风险呈正相关，但其潜在机制尚不清楚。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）
摘要：结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤。流行病学研究表明牙周炎（Periodontitis, PD）与CRC风险呈正相关，但其潜在机制尚不清楚。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是系统性通讯的重要方式，可能介导PD对CRC的远端效应。研究人员建立自发性肠道肿瘤形成Apc+/?小鼠的PD模型，评估结直肠及小肠肿瘤的发生、负荷及进展；从PD或假手术（Sham）小鼠血浆中分离循环EVs并进行鉴定；采用GW4869药理学抑制EV释放及MC38同源肿瘤模型评估EVs的功能贡献；通过代谢组学分析、RNA测序（RNA Sequencing, RNA-seq）及体外功能实验探究EV cargo及潜在机制。结果显示，PD显著加速Apc+/?小鼠CRC发生并增加肿瘤数目与大小；GW4869抑制EV释放可减弱PD驱动的肿瘤进展，表明牙周炎相关EVs（Periodontitis-derived EVs, PDEVs）发挥关键作用。PDEVs促进MC38移植瘤生长并诱导免疫抑制性肿瘤微环境（Tumour Microenvironment, TME）。代谢组学分析发现PDEVs中肌肽（Carnosine）显著富集。在酸性条件下，EV递送的Carnosine缓解细胞内酸中毒，维持溶酶体定位与酸化，并促进MC38细胞增殖、迁移及上皮–间质转化（Epithelial–Mesenchymal Transition, EMT）。综上，本研究揭示循环EV介导的代谢通讯通路连接PD与CRC进展——PDEVs通过递送Carnosine支持恶性表型并协助肿瘤细胞适应酸性应激。循环EV相关Carnosine有望作为潜在生物标志物及干预高危人群CRC进展的候选靶点。
论文解读：牙周炎相关循环细胞外囊泡通过肌肽(Carnosine)介导的酸中毒适应促进结直肠癌进展
研究背景与立题依据
结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球范围内高发恶性肿瘤，牙周炎（Periodontitis, PD）是最常见的慢性口腔炎症性疾病之一。现有流行病学证据提示PD与CRC风险升高存在关联，可能的途径包括慢性炎症、微生物失调及炎症介质入血引发全身低度炎症状态，进而参与多种系统性疾病发生发展。然而PD促进CRC的具体生物学机制仍不明确。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为远距离器官间通讯的重要载体，可携带蛋白质、核酸及代谢物作用于靶细胞并参与肿瘤进程。已有研究发现PD患者循环EVs可促进胰岛素抵抗，提示其可作为PD影响全身疾病的媒介。因此，本研究旨在明确PD来源循环EVs是否及如何通过传递功能性代谢 cargo 促进CRC恶性进展。
主要关键技术方法
研究人员采用双侧上颌第二磨牙丝线结扎法建立C57BL/6J及Apc+/?（自发肠道肿瘤模型）小鼠PD模型，假手术组仅行麻醉及短暂放置后移除丝线。通过差速超速离心法从小鼠血浆中分离循环EVs，并以纳米颗粒示踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）、透射电镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）及Western Blot检测CD9、HSP90等标志物进行鉴定。使用GW4869腹腔注射抑制体内EV释放以进行功能缺失实验。Apc+/?小鼠观察自发肠肿瘤数目、大小及负荷；C57BL/6J小鼠皮下接种MC38细胞建立同源移植瘤模型，予瘤周或尾静脉注射PDEVs/健康小鼠EVs（HEVs）/载肌肽EVs（CarEVs）观察成瘤及免疫浸润（流式细胞术检测CD4+T、CD8+T、NK细胞）。EVs代谢组学采用UPLC-QTOF-MS检测，肌肽（Carnosine）含量用ELISA及LC–MS验证。体外酸模拟（pH 6.7）下以CCK-8、EdU、集落形成、Transwell及伤口愈合实验评估细胞增殖与迁移，qPCR检测EMT标志基因（Snail、Vimentin、Twist、N-cadherin、E-cadherin），Lysotracker Red及Lysosensor Yellow/Blue DND-160检测溶酶体定位与pH，BCECF-AM测胞内pH。RNA-seq分析移植瘤差异基因及GO富集。TCGA数据库（GEPIA）分析CARNS1、溶酶体标志基因（LAMP1、LAMP2、CTSB、CTSD）及NFX1、LGALS9在COAD中的表达与预后。
研究结果
3.1 Periodontitis Accelerates Colorectal Cancer Onset and Progression in Mice
通过Micro-CT、H&E及TRAP染色证实结扎法成功建立小鼠PD模型（牙槽骨吸收、破骨细胞增多）。将PD诱导于Apc+/?小鼠后，疾病活动指数（Disease Activity Index, DAI）显示CRC症状更早出现（10周 vs 14周），终点时结直肠及小肠肿瘤数目、负荷及大肿瘤（≥5 mm）比例均显著高于Sham组，表明PD促进CRC发生与进展。
3.2 Inhibition of PDEVs Release Attenuates PD-Accelerated Tumorigenesis
给予EV分泌抑制剂GW4869后，血浆EV浓度下降，PD+GW4869组DAI延迟出现，结直肠及小肠肿瘤数目、负荷及大肿瘤比例较PD组显著降低，提示循环EVs尤其是PDEVs是PD促CRC进展的关键介质。
3.3 PDEVs Promote MC38 Tumour Malignancy In Vivo and In Vitro
MC38皮下移植瘤模型中，每2天瘤周注射20 μg PDEVs显著增大肿瘤体积与重量；流式细胞术显示肿瘤内CD4+T、CD8+T及NK细胞比例降低，RNA-seq提示免疫应答相关通路受抑，表明PDEVs诱导免疫抑制TME。体外实验中PDEVs（vs Vehicle/HEVs）提高MC38细胞活力（CCK-8）、EdU阳性率、集落数，促进伤口愈合及Transwell迁移，并上调Snail、Vimentin、Twist等EMT标志基因表达，证实PDEVs增强CRC细胞恶性表型。
3.4 Periodontitis-Associated Circulating EVs Deliver Carnosine to the Mouse Intestine
PDEVs与HEVs代谢组学比较显示Carnosine在PDEVs中极显著富集（log2FC=30.19），ELISA证实PDEVs内Carnosine高于HEVs，而去EV血浆中无差异。CARNS1在TCGA结肠癌组织低于正常结肠组织。DiO标记EVs尾静脉注射2 h后可在小鼠肠组织检出，单独注射PDEVs使肠组织Carnosine水平升高；冻融破坏PDEVs膜后递送Carnosine能力丧失，说明Carnosine由完整EVs包裹并运输至肠道。
3.5 Carnosine-Enriched EVs Promote Malignant Phenotypes and EMT of MC38 Cells Under Acidic Conditions
将Carnosine载入HEVs制得CarEVs（LC–MS验证）。在模拟肿瘤酸性微环境（pH 6.7）下，CarEVs（而非游离Carnosine或HEVs）显著促进MC38细胞增殖（EdU、集落形成）、迁移（Transwell、伤口愈合）及EMT标志基因上调，且该促癌效应可被溶酶体功能抑制剂Bafilomycin A1逆转，提示CarEVs依赖溶酶体途径在酸性条件下发挥促癌作用。
3.6 CarEVs Alleviate Intracellular Acidosis, Restore Lysosomal Function in MC38 Cells and Regulate the NFX1–Galectin-9 Signalling Axis in MC38
pH 6.7+CarEVs组胞外pH降低、胞内pH升高，缓解细胞内酸中毒；Lysotracker显示溶酶体更靠近核且LysoSensor指示溶酶体pH更低（更酸化），qPCR示溶酶体标志基因（Lamp1、Lamp2、Ctsb）表达上调，说明CarEVs维持酸性应激下溶酶体功能。TCGA数据显示LAMP1/2、CTSB/CTSD在COAD高表达且与不良预后相关。Western Blot显示酸性条件下NFX1上调、Galectin-9下调，CarEVs处理逆转此变化（NFX1↓、Galectin-9↑），且该逆转被BafA1削弱，表明CarEVs通过Carnosine缓冲作用恢复溶酶体稳态进而调控NFX1–Galectin-9轴。
讨论与结论总结
本研究阐明了一条"口腔–循环EVs–肠肿瘤"轴：PD状态下循环PDEVs富集缓冲代谢物Carnosine，经血流递送至结直肠肿瘤部位，被CRC细胞内吞后Carnosine缓解Warburg效应导致的胞内酸中毒、维持溶酶体酸化与功能，进而通过NFX1–Galectin-9信号轴促进肿瘤细胞增殖、迁移、EMT及免疫逃逸，最终加速Apc+/?小鼠CRC进展。抑制EV释放可阻断该效应。本研究拓展了PD促CRC的机制认识，超越传统口腔致病菌定植范式，强调了系统性EV介导代谢通讯的重要性。局限性包括仅在Apc+/?模型验证、PDEVs中Carnosine的组织来源（可能为肌肉/脑经系统性重分布）未完全阐明及临床人体验证待开展。循环EV相关Carnosine有望作为PD合并CRC高危人群的潜在风险分层生物标志物，靶向EV分泌或肿瘤代谢性酸中毒适应可作为CRC干预新方向。论文发表于《Cell Proliferation》。
