《Nature》：Connecting single-cell transcriptomes to projectomes in the mouse visual cortex
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哺乳动物大脑由功能各异的多种神经元类型构成。近期单细胞RNA测序方法已建立了全脑细胞类型的转录组学分类。Patch-seq实验通过将转录组谱与局部形态学和电生理学特性相关联，增强了这些细胞类型的描述。然而，将转录组身份与长距离轴突投射联系起来仍是一个重大未解挑
哺乳动物大脑由功能各异的多种神经元类型构成。近期单细胞RNA测序方法已建立了全脑细胞类型的转录组学分类。Patch-seq实验通过将转录组谱与局部形态学和电生理学特性相关联，增强了这些细胞类型的描述。然而，将转录组身份与长距离轴突投射联系起来仍是一个重大未解挑战。为此，研究人员从小鼠视觉皮层收集了两个数据集：(1) 1,528个兴奋性Patch-seq神经元，每个细胞均具有局部形态学、电生理学和转录组数据；(2) 341个兴奋性全神经元形态。基于Patch-seq数据，研究人员定义了17个形态电生理-转录组（MET）类型，并构建了多步分类器，将细胞类型分配与全神经元形态整合，以探究跨模态关系。研究发现，MET类型内和跨MET类型的转录组变异与形态学和电生理学表型相对应。此外，这些基因表达模式以及细胞的解剖位置可用于预测单个神经元的投射靶标。研究人员观察到了第5层端脑内侧（L5 IT）和端脑外侧（L5 ET）神经元的新型多模态细胞类型特征，并揭示了其轴突回路的新见解，包括半球间端脑内侧投射。该方法建立了全面的、整合的皮层兴奋性神经元类型分类学，并创建了一个可扩展到全脑甚至跨物种的高维细胞类型分类系统。
研究背景与意义
哺乳动物大脑的神经元具有极大的形态多样性，传统的Golgi染色首次揭示了这种复杂性。近年来，解剖示踪、单细胞转录组学和电子显微镜等技术极大拓展了人们对脑细胞类型的认识。然而，这些技术大多孤立地研究细胞的单一属性，缺乏跨模态的对应关系来建立稳健的整合细胞类型定义。Patch-seq技术能够同时从同一细胞中获取电生理、形态和转录组数据，但如何将转录组定义的细胞类型与完整的长距离轴突投射联系起来，一直是一个悬而未决的问题。因为转录组学研究虽然揭示了比传统形态电生理分类更多的皮层细胞类型，但其与完整轴突投射的关系在很大程度上缺失。为了填补这一空白，研究人员开展了本研究，相关成果发表在《Nature》上。
关键技术方法概述
研究人员主要采用了两项关键技术。第一项技术是Patch-seq，他们从成年小鼠视觉皮层采集了1,528个兴奋性神经元的电生理、局部形态和转录组三联数据，其中部分神经元进行了树突重建。第二项技术是全神经元形态（WNM）重建，利用转基因小鼠结合病毒标记，通过荧光显微光学切片断层成像（fMOST）获取了341个神经元在全脑范围内的完整树突和轴突形态，并将图像注册到艾伦小鼠脑共同坐标框架（CCFv3）。在此基础上，研究人员开发了基于形态学的多步分类器，将两个数据集进行跨平台和跨模态整合，并利用稀疏降秩回归（sRRR）分析基因表达与表型特征的关联，最后使用逻辑回归模型预测投射概率。样本队列来源于精心挑选的转基因小鼠，涵盖了不同的皮层层次和投射亚型。
研究结果
整合的MET兴奋性神经元类型分类学
研究人员利用Patch-seq数据，基于转录组、电生理和局部树突形态，通过社区检测算法定义了17个MET类型。他们训练了一个随机森林分类器，仅使用树突和胞体特征就能以超过90%的准确率预测MET类型，证明局部形态是大多数视觉皮层MET类型的决定性特征。为了将MET类型与WNM数据集联系起来，他们建立了一个多步形态分类器，首先根据长距离投射模式将WNM神经元分配到 broad 投射类别（IT、ET、CT等），然后使用专门分类器预测具体的MET类型。该框架成功地将WNM神经元映射到相应的MET类型，实现了两个数据集的整合，为兴奋性神经元提供了统一的多模态描述。
IT MET类型
在IT（端脑内侧投射）MET类型中，研究人员观察到转录组UMAP显示不同T类型呈层状分布，而电生理和形态UMAP则显示了不同程度的分离。L5/L6 IT Car3类型在形态上表现为深层的棘星状神经元，在电生理上具有独特的去极化上升时间和“驼峰”电位，并差异表达Trpc通道等基因。在WNM预测的IT MET类型中，局部轴突分布具有明显的类型特异性：L2/3 IT主要支配浅层，L4 IT具有密集的柱状轴突，L4/L5 IT支配L1和浅L5，而L5 IT-2则密集支配L2/3和深L5。长距离投射分析表明，L4/L5 IT和L5/L6 IT Car3拥有最广泛的投射，且L5/L6 IT Car3具有更强的对侧投射偏好，这揭示了它们在半球间信号传递中的不同作用。
ET、NP、CT和L6b MET类型
对于ET（端脑外侧投射）、NP（近投射）、CT（皮层丘脑投射）和L6b MET类型，研究人员发现L5 ET-1 Chrna6在转录组、电生理和形态上均独树一帜，该类型很少产生动作电位爆发，且投射靶标数量显著少于其他L5 ET类型。L5 NP神经元表现出较高的兴奋性和独特的形态。WNM分析证实了这些类型在局部轴突分布上的差异：L5 ET局部轴突较少，L5 NP有大量轴突支配L6，L6 CT轴突呈楔形局限于深层，L6b则强烈支配L1。在投射模式上，L5 ET共享许多丘脑和脑干靶标，但Chrna6类型靶标较少；L6 CT主要投射到丘脑特定核团；L6b则主要投射到同侧高级视觉区和压后皮层。
转录组变异与跨模态对应
研究人员应用稀疏降秩回归（sRRR）分析，发现转录组变异能够预测电生理和形态特征的变化。在大多数亚类中，第一个电生理潜因子与动作电位波形特征相关，而形态潜因子则与顶端树突的大小、复杂度及皮层深度相关。相关基因涉及细胞粘附分子、突触蛋白和离子通道等。sRRR潜因子与转录组主成分（Tx PCs）也存在相关性，表明转录组梯度与表型变异是共享的。这些结果说明，尽管多个T类型可能合并为一个MET类型，但细胞内的基因表达梯度仍然与多模态表型变化协调一致。
跨数据集连接多模态特性
研究人员利用sRRR的权重，从WNM神经元的局部树突特征中估算潜因子，进而推断其与轴突特性的关系。他们观察到多个转录组相关潜因子与局部轴突特性（如轴突深度分布）和完整轴突 Arbor 特性（如轴突总长度）显著相关。这表明转录组差异不仅与局部形态电生理相关，也与长距离投射模式相关联。
预测单个细胞特性的投射概率
基于逻辑回归模型，研究人员结合形态潜因子和视觉皮层表面位置，成功预测了VISp中WNM神经元投射到特定靶区的概率。模型表现优于零模型，其中位置信息对预测皮层内投射尤为重要，而潜因子对预测某些皮层下靶区（如外侧后核LP、背侧外侧膝状体核LGd）更为关键。通过留一法交叉验证，模型对单个神经元实际投射靶标的预测显示出良好的实用性，证明了整合多模态特征理解大脑连接多样性的价值。
总结与讨论
研究人员在讨论中指出，本研究收集并整合了大规模Patch-seq和WNM数据集，定义了17个兴奋性MET类型，并描绘了它们的轴突特性。他们发现了新型的L5 IT和ET整合细胞类型特征，表征了转录组相关的表型特性，并揭示了预测轴突靶标的基因表达模式。具体而言，L5/L6 IT Car3具有广泛的对侧投射，而L5 ET-1 Chrna6则在所有模态上均独特且投射靶标较少。通过sRRR分析，研究人员展示了转录组变异如何预测表型变异，并利用逻辑回归模型预测了特定投射靶标。该研究建立的兴奋性视觉皮层MET类型分类学和跨数据集映射的计算框架，能够与突触连接等其他重要数据模态整合，为加速理解大脑的组织和功能提供了必不可少的基石。论文发表在《Nature》，彰显了该研究在神经科学领域的重大意义。
