利用GPNMB CAR-T细胞对胶质母细胞瘤进行肿瘤-髓系双靶向治疗

《Nature》：Dual tumour–myeloid targeting of glioblastoma with GPNMB CAR-T cells

　　

胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）是一种致死性脑肿瘤，目前的多模式治疗仍难以阻止其复发。治疗失败源于显著的肿瘤内细胞异质性，以及以肿瘤相关巨噬细胞（tumour-associated macrophages, TAMs）为主导的免疫抑制性肿瘤微环境，这些TAMs维持肿瘤生长并介导免疫抑制。尽管针对GBM的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）T细胞疗法正在研发，但持续疗效受限于抗原表达不均、抗原丢失以及传统肿瘤靶向设计未能直接应对的微环境障碍。这些局限促使研究将疾病视为耦合的肿瘤-免疫系统，而非单一恶性区室。研究人员利用多组学靶点发现平台，鉴定出GPNMB是GBM中的双区室抗原。抗GPNMB CAR-T细胞展现出强效的抗肿瘤活性，在正位患者来源异种移植（orthotopic patient-derived xenografts, PDX）及同源胶质瘤模型中实现长期疾病控制，机制在于同时清除GPNMB⁺肿瘤细胞和免疫抑制性髓系细胞群体。该研究通过整合肿瘤控制与微环境重编程，为异质性、髓系富集的实体瘤提供了抗原选择与靶向治疗的新策略。

胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）是成人最具侵袭性的原发性脑肿瘤，标准治疗（手术、放疗、化疗）获益短暂，中位总生存期不足15个月且几乎必然复发。其核心挑战在于深刻的空间和时间异质性，使肿瘤在治疗压力下快速适应；同时，肿瘤微环境（tumour microenvironment, TME）被肿瘤相关巨噬细胞（tumour-associated macrophages, TAMs）主导，进一步抑制抗肿瘤免疫。胶质瘤干细胞（glioma stem cells, GSCs）具有自我更新和多向分化潜能，对治疗和复发贡献突出，并能通过表型转换及特定微环境niche存活。现有CAR-T细胞疗法面临靶抗原表达不均、抗原丢失和局部免疫抑制等瓶颈。因此，亟需寻找在肿瘤细胞和GSCs上共同表达、且与维持肿瘤的间质或免疫细胞关联的表面抗原。本研究发表于《Nature》，旨在通过整合多组学策略发现GBM新治疗靶点，并开发可同时攻击肿瘤和免疫抑制性TAMs的CAR-T细胞。

研究方法包括：对分选的CD133⁺/CD133^?原代GSCs行RNA测序（RNA-seq），结合TCGA/GTEx数据库、成对原发-复发肿瘤蛋白质组学与免疫组织化学（IHC），以及18例原发/复发GBM标本的单细胞RNA测序（scRNA-seq）；用CRISPR-Cas9敲除患者来源GSCs和小鼠GL261中的GPNMB/Gpnmb；以glembatumumab vedotin来源的单链可变片段（scFv）构建二代CAR并转导人/鼠T细胞；在NSG正位PDX、NOG-EXL人源化小鼠和C57BL/6同源GL261模型中评估疗效；通过非负矩阵分解（NMF）构建CNS髓系scRNA-seq图谱。样本队列来自Hamilton Health Sciences及McMaster大学伦理委员会批准（编号16078）的GBM患者。

**GPNMB是GBM的治疗靶点**
研究人员比较CD133⁺与CD133^? GSCs的转录组，发现GPNMB在CD133^?亚群中显著上调。TCGA与GTEx数据、15株GSCs流式检测及成对原发-复发蛋白质组/IHC均显示，GPNMB在GBM中高于正常脑组织，且在复发瘤中进一步升高。scRNA-seq分析18例原发/复发标本发现GPNMB转录本主要分布于恶性细胞和髓系细胞，复发样本表达更高，正常成人脑组织几乎不表达。这些结果确立GPNMB为可安全靶向的肿瘤表面抗原。

**GPNMB驱动GBM生长**
CRISPR-Cas9敲除GPNMB显著降低多株患者来源GSCs的体外增殖，并延长正位NSG小鼠生存。GL261同源模型中Gpnmb敲除同样减缓细胞增殖、延长荷瘤小鼠生存，提示GPNMB内在地促进肿瘤生长。

**GPNMB支持MES样状态与免疫募集**
对野生型与Gpnmb敲除GL261肿瘤的scRNA-seq分析显示，敲除后肿瘤上调氧化磷酸化和MYC信号，下调Notch、TGFβ及整合素介导的黏附通路；免疫细胞浸润中髓系比例下降、淋巴细胞比例上升；恶性细胞偏向发育样（寡突胶质细胞前体样/神经前体样）和星形胶质样状态，而间充质样（mesenchymal-like, MES-like）程序减少。这表明GPNMB调控肿瘤-髓系互作并维持MES样状态。

**GPNMB CAR-T细胞展现强效抗GBM活性**
采用glembatumumab vedotin scFv构建的二代抗GPNMB CAR-T细胞在体外对人GSCs呈剂量依赖性杀伤，激活标志CD25、CD69及IFNγ、TNF分泌显著升高，对GPNMB敲除靶细胞毒性降低。在正位GBM4/GBM8 PDX模型中，两次颅内输注GPNMB CAR-T细胞可完全清除肿瘤并实现长期无病控制（>120–160天）。在CD133 CAR-T治疗后复发的PDX中，续贯GPNMB CAR-T仍能完全清除残余肿瘤，提示其可作为二线或联合策略。

**GPNMB CAR-T细胞在人源化PDX中有效**
在重建人淋巴和髓系谱系的NOG-EXL人源化小鼠中，BT972复发GSC PDX经GPNMB CAR-T治疗后大部分肿瘤显著缩小。多重免疫荧光显示GPNMB⁺肿瘤细胞被大量清除，CD4⁺/CD8⁺ T细胞浸润增加，并可见GFP⁺ CAR-T及内源性T细胞；CD163⁺ TAMs仍存在并高表达CD206，可能参与吞噬肿瘤碎屑和GPNMB阳性物质。

**GPNMB CAR-T细胞同时靶向肿瘤和TAMs**
U937巨噬细胞经IL-4/IL-10/TGFβ或GSC条件培养基诱导后GPNMB表达升高，而IFNγ刺激后较低。GPNMB CAR-T细胞选择性裂解免疫抑制性巨噬细胞，而保留促炎型。三培养体系中CAR-T同时杀伤iRFP标记的GBM8肿瘤细胞和U937巨噬细胞。在GSC-巨噬细胞共接种NSG模型中，GPNMB CAR-T显著抑制肿瘤并延长生存，多重免疫荧光证实GPNMB⁺IBA1^?肿瘤细胞及GPNMB⁺IBA1⁺巨噬细胞均被清除。

**GPNMB阳性CNS髓系细胞的scRNA-seq图谱**
研究人员整合多种中枢神经系统（CNS）生理与病理状态下髓系群体的scRNA-seq数据，通过NMF识别17个基因程序；GPNMB高表达与脂质转运、缺氧程序及免疫抑制性M2样特征相关，脂蛋白形成/运输基因（APOC1、APOE、PLTP、LRP1）及肝X受体信号富集。这提示GPNMB^hi巨噬细胞在脂代谢和免疫抑制中的功能角色。

**鼠源化GPNMB CAR-T细胞具有治愈效果**
为验证免疫健全模型，研究人员以CSTREVL抗体来源scFv构建鼠源化抗mGpnmb CAR-T。该CAR-T在体外高效杀伤GL261，在C57BL/6正位GL261模型中实现超过100天的长期控制，且无显著毒性。免疫荧光显示GPNMB⁺IBA1^?肿瘤细胞和GPNMB⁺IBA1⁺巨噬细胞均被清除，证明在完整免疫系统中仍可双靶向肿瘤与髓系区室。

上述结果表明，GPNMB CAR-T治疗不仅直接杀伤恶性细胞，还通过破坏TAM介导的免疫抑制生态位重塑TME，形成肿瘤-髓系双重靶向范式。GBM中TAMs多样性及GPNMB^hi TAMs与脂质转运、免疫抑制和MES样niche的关联提示，同时攻击肿瘤细胞和支持性髓系细胞可能获得更持久的疾病控制。研究也指出若干转化方向：局部给药可在GPNMB低表达正常脑组织中扩大治疗窗；未来可通过TRAC敲入、逻辑门控CAR、多抗原或装甲CAR（如IL-12、IL-15、IL-18或检查点阻断）进一步优化安全性与疗效。

研究结论：抗GPNMB CAR-T细胞疗法能够阻止GBM细胞逃避免疫识别，并对GBM细胞及其对应的TME发挥多向细胞毒性，这为目前治疗选择有限的髓系富集肿瘤（如GBM）提供了一种前景广阔的新策略。更广泛地看，研究结果支持将GBM视为一个耦合的肿瘤-髓系系统进行治疗，持久控制需要同时打击恶性程序及其维持的免疫抑制性髓系niche。