靶向TROP2揭示结直肠癌治疗驱动的细胞状态动态

《Nature》：TROP2 targeting reveals therapy-driven cell state dynamics in colorectal cancer

　　

转移（metastasis) 仍是癌症相关死亡的主要原因，其驱动因素为显著的肿瘤细胞可塑性(plasticity)。本研究鉴定出跨膜糖蛋白滋养层细胞表面抗原2（trophoblast cell-surface antigen 2, TROP2）作为预后不良结直肠癌（colorectal cancer, CRC）的标志物，其与WNT^low、胎儿样肿瘤细胞状态相关，而该状态与转移和治疗耐药相关。功能分析表明，TROP2⁺细胞表现出情境依赖性的干细胞样能力和启动转移性生长的能力。鉴于这些有害的肿瘤状态汇聚于细胞表面抗原TROP2，研究人员探索了使用临床相关的TROP2靶向抗体偶联药物（antibody-drug conjugate, ADC）对这一细胞群体进行治疗性靶向。时间分辨分析揭示了肿瘤细胞状态组成在治疗相关的WNT^hi LGR5⁺状态与WNT^lowTROP2⁺胎儿样状态之间的动态变化。常规化疗促进TROP2表达细胞的诱导，而TROP2抗体偶联药物则选择性靶向这些群体并重塑肿瘤细胞状态景观。利用这种可塑性，联合化疗与TROP2靶向治疗在患者来源的模型中增强了抗肿瘤效果。综上所述，研究结果鉴定出TROP2是CRC的治疗脆弱性，并强调了靶向肿瘤细胞状态以提高治疗效果和克服晚期疾病耐药性的重要性。

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球癌症相关死亡的第二大原因，其高致死率主要归因于诊断时已存在播散性肿瘤细胞以及全身性治疗 ineffective。约占CRC病例90%的微卫星稳定型CRC的标准治疗方案是细胞抑制剂联合方案，如5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU)联合伊立替康(FOLFIRI方案)或奥沙利铂(FOLFOX方案)。然而，细胞可塑性(plasticity)似乎是治疗耐药的关键驱动因素。尽管靶向血管内皮生长因子受体或表皮生长因子受治疗可提高临床疗效，但IV期患者5年总体生存率仅为12%，凸显了改善晚期CRC患者治疗选择的紧迫需求。

预后不良CRC仍是严峻的临床挑战。分子特征分析揭示，预后不良的肿瘤特别以低WNT信号为特征，属于锯齿状亚型(serrated subtype)。进一步转录组亚型分型方法发现了四种共识分子亚型(consensus molecular subtypes, CMSs)，而单细胞测序将CMS细化为内在CMS(intrinsic CMS, iCMS)，其中iCMS3赋予癌细胞预后不良特征。另一项基于通路衍生亚型(pathway-derived subtypes, PDSs)的分类策略中，PDS3在局部晚期疾病中显示出最差预后。所有这些预后不良、治疗抵抗性亚型均表现出类似的低WNT通路活性，但这些分类尚未进入临床实践用于患者分层或治疗策略。

癌症干细胞(cancer stem cells, CSCs)是具有增强自我更新能力、对癌症维持、 dominance 延长、治疗抵抗和转移至关重要的癌细胞群体。源于肠道成体干细胞的LGR5表达细胞最初被定义为CRC的起源细胞和CSCs。LGR5⁺癌细胞的耗竭揭示了细胞可塑性的存在，显示LGR5⁺ CSC池在情境依赖的方式中快速 replenishment 的现象。CSCs的耗竭显著减少肝脏转移瘤，而追踪转移级联中的细胞动态发现，离开原发肿瘤的肿瘤细胞大多不表达LGR5，却显示YAP信号激活。类似地，药物耐受持续细胞(drug-tolerant persister cells)重新获得胎儿样细胞标志物的表达。值得注意的是，胎儿样癌细胞在多种与患者预后相关的疾病关键过程中被检测到，如转移过程中缺乏LGR5⁺成体肠道干细胞(intestinal stem cells, ISCs)，而这些细胞获得L1CAM或EMP1的表达，这些标志物也可识别再生态、MAPK活跃态或高复发细胞(high-relapse cell, HRC)状态中的群体。

近年来，抗体偶联药物(ADCs)作为多种癌症类型的靶向治疗策略受到 rapidly growing 关注。TROP2是一种跨膜糖蛋白，最初在小鼠滋养层细胞中鉴定，由肿瘤相关钙信号转导因子2(tumour-associated calcium signal transducer 2, TACSTD2)基因编码。TROP2在多种癌瘤中大量表达，而在大多数成人组织中缺如，这一特征激发了TROP2靶向ADCs开发的高度兴趣。这类ADCs，如首创产品sacituzumab govitecan (SG/Trodelvy)或sacituzumab tirumotecan (Sac-TMT)，由人源化抗TROP2单克隆抗体(hRS7)与拓扑异构酶抑制剂SN-38或KL610023偶联而成。SG已于2021年获常规批准用于转移性乳腺癌患者。TROP2靶向ADCs的成功推动了众多TROP2-ADCs的临床开发，涵盖I至III期多种癌症。

CRC进展和治疗抵抗过程中 distinct 细胞状态的出现凸显了靶向这些状态的治疗需求。研究人员对人类CRC的谱系分析鉴定出TROP2作为与CRC进展、胎儿样细胞和高复发细胞状态相关的临床相关候选标志物。功能研究表明，TROP2标记在缺乏WNT信号传导的肿瘤细胞中具有增强自我更新能力的细胞。研究人员观察到LGR5⁺和TROP2⁺细胞状态之间存在二元分割，且二者之间存在显著可塑性。CRC挑战实验显示化疗增强TROP2表达，而TROP2靶向ADC与化疗联合治疗显示增强的疗效。综上，靶向特定细胞状态介导治疗抵抗，可通过机制指导的细胞状态选择性联合疗法克服。

**TROP2定义预后不良CRC细胞**

侵袭性CRC与低WNT信号活性的肿瘤相关。为定义CRC中高转移性和耐药细胞，研究人员分析了公开数据集中WNT信号靶点和干细胞标志物LGR5、ASCL2和AXIN2的表达，发现这些基因表达与较长的无复发生存期显著相关。为鉴定与较短无复发生存期和CRC进展相关的基因，研究人员应用了先前证明与治疗抵抗相关且在WNT^low锯齿状CRC中增强的胎儿基因标签(fetal gene signature)，鉴定出两个在CRC中高表达且与晚期肿瘤分期正相关的胎儿基因：编码TROP2的TACSTD2和编码骨桥蛋白(osteopontin)的SPP1。研究人员聚焦于上皮表达的跨膜蛋白TROP2，因为骨桥蛋白主要在CRC的基质区室中大量表达。

在246例根据肿瘤分期、分级和原发肿瘤部位匹配的病例-对照队列中，TROP2表达与远处转移显著相关(37.8% vs 17.1%)。此外，高TROP2表达与晚期局限性CRC(国际抗癌联盟(UICC) II期，pT3/4)的较短无病生存期相关，并在16个公开队列共1,336例CRC患者中得到验证。与此一致，TACSTD2表达在预后不良的iCMS3和PDS3亚型中升高，而LGR5呈负相关。为进一定义TROP2表达和癌细胞程序，研究人员对CRC原发肿瘤和肝转移瘤集合进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)，并生成患者来源类器官(patient-derived organoids, PDOs)和PDOs异种移植(patient-derived organoid xenografts, PDOXs)进行scRNA-seq分析。

上皮肿瘤细胞区的细胞集群注释揭示了先前定义的集群存在，包括revival干细胞(以CLU为标志)、增殖性和非增殖性LGR5 集群，以及与药物耐受持续细胞相关的MEX3A富集集群。此外，鉴定出两个TACSTD2表达增加的集群：一个富集上皮高复发细胞，另一个富集胎儿样细胞/高复发细胞。尽管TACSTD2和EMP1在相似集群中表达，但双阳性细胞仅占一小部分。值得注意的是，TACSTD2表达细胞和LGR5表达细胞在数据集和公共数据集中似乎定义了两个 distinct 细胞群体。这些数据表明TROP2定义了与人类CRC不良预后相关的细胞群体。

研究人员还生成了一系列定义CRC经典途径或锯齿状途径进展的基因工程小鼠模型(genetically engineered mouse models, GEMMs)，这些模型为研究晚期CRC的逐步进展提供了 excellent 工具箱。研究人员在基因定义的小鼠来源类器官(mouse-derived organoids, MDOs)中分析了TROP2表达，发现从良性模型到侵袭性腺癌模型再到高转移性腺癌模型，TROP2水平随致瘤性负荷增加而升高，而L_sheet_structure Lgr5或胎儿样标志物并不遵循这种逐步增加。在转移模型VKPN和VAKPS的肿瘤单细胞转录组学中，确认了独立的Tacstd2⁺、Lgr5⁺或Emp1⁺细胞的存在，以及Tacstd2表达与胎儿样细胞的关联。综上，TROP2被鉴定为预后不良细胞状态的标志物。

**TROP2标记WNT^low CRC的CSCs**

为研究TROP2⁺细胞在癌症干性中的功能作用，研究人员分离TROP2^?和TROP2⁺(前20%)细胞群体进行体外培养。在处于各阶段的MDOs和PDOs中，TROP2⁺细胞表现出增加的克隆形成能力。值得注意的是，培养7天后，来自TROP2^?或TROP2⁺分选群体的类器官显示出相似的TROP2水平，表明高度的可塑性。TROP2⁺细胞比例较低的PDOs未显示TROP2⁺细胞体外种植能力的显著增加，而使用WNT/LGR5报告基因(STAR)标记时，LGR5/WNT^hi细胞显示出增加的种植效率。

研究人员评估了TROP2细胞的体内肿瘤启动能力。在低WNT/LGR5表达模型和高WNT/LGR5表达模型中，TROP2⁺细胞在低WNT模型中显示出增强的肿瘤启动能力，而在高WNT模型中未表现出增加的肿瘤启动能力。两种肿瘤类型中，高度的细胞可塑性导致TROP2⁺细胞池随时间恢复。这些结果突显了CRC细胞的增强可塑性，并提示对TROP2⁺细胞池 replenishment 的潜在依赖性。

为确定CRC模型中LGR5表达细胞的干细胞能力，研究人员进行交流hd对生活 arranging 荧光蛋白tdTomato敲入Lgr5基因STOP密码子后的实验。定量PCR分离的tdTomato^?和tdTomato^hi细胞证实了tdTomato^hi细胞中tdTomato和Lgr5的 higher 表达，表明tdTomato选择性标记了Lgr5⁺细胞。在VAKPS^LT细胞中，tdTomato⁺细胞显示出增加的克隆形成潜能，但这种差异在WNT^low VKPN^LT MDOs中检测不到。使用CRISPR-Cas9基因编辑删除Apc后，这些MDOs显示出显著更高的tdTomato和WNT靶基因表达，且tdTomato⁺细胞的克隆形成能力也增加。值得注意的是，当种植tdTomato^?细胞时，LGR5群体迅速恢复。

为进一步探索体内LGR5⁺肿瘤细胞的干性特性，研究人员从皮下肿瘤中分离tdTomato^?和tdTomato⁺肿瘤细胞并移植到次级受体小鼠 flank 中。与体外数据相似，tdTomato⁺细胞比tdTomato^?细胞具有更高的肿瘤启动能力，但仅在Apc缺失的肿瘤中。这些发现表明，LGR5主要标记高WNT(Apc缺失)CRC中的CSCs，而TROP2⁺细胞在低WNT信号传导(Apc野生型)CRCs中具有干细胞样肿瘤启动能力。

**TROP2定义转移启动细胞**

转移启动细胞(metastasis-initiating cells, MICs)和微转移灶代表CRC进展中高度相关的患者阶段。尽管LGR5的丢失已在肿瘤侵袭前沿观察到，但胎儿样状态被描述为转移性进展的关键。为定义TROP2⁺细胞在转移性定植中的相关性并探究细胞状态之间的功能可塑性，研究人员分析了从微转移至小转移灶再到大转移灶各转移阶段的 TROP2表达。研究人员在较大病灶中检测到LGR5表达，而TROP2在转移性种植的初始事件中即已存在。

为检测TROP2⁺细胞在转移形成期间的相关性，研究人员按TROP2和LGR5水平从VAKPS^LT和VKPN^sup>LT肿瘤中分离肿瘤细胞。在转移性种植实验中，VAKPS^LT肿瘤的LGR5⁺分选细胞比LGR5^?细胞具有显著更高的转移能力。然而，当比较LGR5⁺/TROP2^?和LGR5⁺/TROP2⁺细胞形成大转移灶的潜力时，双阳性细胞形成的转移灶显著更多。此外，当评估LGR5^?细胞(先前定义为MICs)的转移能力时，研究人员检测到TROP2⁺细胞的转移效价显著增加。在VKPN^LT MDOs中，无论LGR5水平如何，两个TROP2⁺分选细胞群体均比TROP2^?细胞群体具有显著更高的转移能力，与其体外增加的种植效率一致。总之，TROP2⁺细胞在VAKPS和VKPN模型中均比TROP2^?细胞具有更高的转移能力。此外，所有生成的转移灶迅速恢复了平衡的细胞状态 equilibrium，展示了CRC细胞的高度可塑性。

**TROP2靶向与细胞状态重塑**

研究结果表明，TROP2表达细胞与不良临床结果相关的肿瘤细胞群体相关联，因此靶向这些细胞具有高度临床相关性。近年来，TROP2靶向ADCs如SG的使用在三阴性乳腺癌中显示出惊人疗效和临床成功。因此，研究人员旨在CRC中靶向TROP2表达细胞。研究人员使用TROP2表达异质性的患者来源CRC样本生物库，生成的PDOs和PDOXs重现了原发组织中发现的TROP2表达和膜定位。对PDOXs的SG治疗突显了TROP2表达依赖性的生存获益，这种获益伴随着TROP2细胞表面蛋白水平的降低。

研究人员考虑TROP2⁺细胞靶向可能重塑肿瘤的细胞状态组成。SG处理和载体处理的PDOX肿瘤的单细胞转录组学揭示了九个上皮集群的存在，包括ISCs(以LGR5为标志)、revival干细胞(以CLU为标志)、胎儿样细胞(以TACSTD2为标志)或HRCs(以EMP1为标志)。分析显示，SG治疗与HRC样和胎儿样标签的显著减少以及ISC/LGR5标签的增加相关。为解析这种动态的时间进程，研究人员分析了体内治疗时间过程实验的PDOs。单次SG剂量在首个48小时内导致细胞状态组成的明显变化，导致TROP2⁺和胎儿样细胞为代价的LGR5程序上调。Palantir轨迹推断进一步显示SG治疗期间从TROP2^hi状态向ISC样LGR5细胞状态的转变。这种细胞状态转变在药物效应减弱时是可逆的。

在体外药物释放后的药物时间过程中，SG处理显示治疗期间WNT程序的上调，随后药物释放时HRC样、非典型样和胎儿样程序的明显再现。这种基因表达程序的可塑性变化在未靶向ADC中未观察到，后者主要显示药物释放时LGR5标签的出现。总之，靶向TROP2⁺细胞导致向ISC状态的状态重塑。

**化疗诱导的TROP2与可塑性**

为定义在临床应用相关情境中驱动TROP2表达的机制，研究人员检测了各种PDOs的FOLFIRI治疗。在所有模型中，无论基础TROP2水平如何，均观察到TROP2表达的诱导。即使在基线时每细胞均表达TROP2的肿瘤中，FOLFIRI暴露后也发现TROP2表面水平显著增强。VAKP MDOs在体外和体内的FOLFIRI暴露也检测到TROP2诱导，这种诱导在药物撤除96小时后可逆转，表明高度的可塑性。值得注意的是，相同FOLFIRI处理的小鼠或人正常组织类器官和小鼠结肠组织未显示TROP2诱导。

为区分TROP2表达是化疗诱导的还是TROP2表达细胞被选择性富集，研究人员通过将CreER开放阅读框引入Tacstd2基因的5'非翻译区(5'UTR)并连接T2A位点，生成了Tacstd2CreER等位基因。功能验证显示，仅皮肤在tamoxifen注射后出现tdTomato标记，而小肠、结肠、肝脏和胰腺保持阴性。此外，正常肠源类器官的tdTomato标记评估显示，10天后Tacstd2等位基因未显示任何tdTomato标记细胞，而Lgr5^GFP-CreER Rosa26^LSL-tdTomato小肠类器官显示高效标记，证明了正常组织中缺乏TROP2表达。

为转化这些类器官，研究人员使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑敲除Apc和Trp53(TcT-AP)，并引入CRC中最普遍的Kras^G12D突变(TcT-AKP)。TcT-AP和TcT-AKP MDOs的FOLFIRI处理在该两种基因型中均诱导TROP2的mRNA和蛋白水平表达，以及胎儿样标志物Krt7和Anxa1。相反，Lgr5表达降低。为检测FOLFIRI处理是否导致持续细胞选择，研究人员将生成的TcT-AKP MDOs进行脾内注射，并对出现的肝转移灶中的克隆扩增进行谱系追踪。tdTomato克隆的纵向分析显示各处理组之间无显著差异，提示化疗上调TROP2水平。为 dissect 转录细胞状态重塑的动态，研究人员在PDOs中进行了纵向处理分析，检测到TROP2蛋白和mRNA的时间依赖性增加，以及LGR5的下调。轨迹推断和伪时间分析提示FOLFIRI诱导的TROP2^hi状态增加，而药物释放揭示向LGR5/WNT^hi细胞状态的逆转。总之，化疗诱导TROP2表达，伴随治疗相关的肿瘤细胞状态变化。

**联合治疗增强疗效**

研究人员证明化疗诱导TROP2表达，与耐药相关的治疗诱导细胞状态一致，因此提出化疗与SG联合治疗可能增强治疗效果的假设。研究人员使用表达不同基础TROP2丰度的PDOs范围进行检测。FOLFIRI或FOLFOX处理显著增强TROP2表达，SG单药和联合治疗均导致表面TROP2表达细胞的显著减少。PDOs移植后，研究人员检测到FOLFOX和SG联合治疗相比各单药治疗小鼠生存显著增加。早期转移与已建立的大转移灶治疗揭示TROP2表达依赖性疗效，对TROP2^hi细胞有强劲效果。联合治疗对TROP2^low细胞也显示出减少的生物发光信号。

当将单药或联合标准护理化疗与Sac-TMT联合时，观察到延迟的肿瘤生长，未检测到毒性。这些数据表明这些药物的联合治疗增强了肿瘤细胞杀伤。总之，这些发现支持一个模型：LGR5⁺和TROP2⁺肿瘤细胞群体以不同状态共存。化疗优先靶向LGR5⁺细胞并诱导TROP2表达，导致肿瘤细胞状态转变。这为TROP2⁺细胞的定向靶向创造了机会。数据支持一种治疗策略，即化疗联合TROP2靶向通过细胞状态特异性肿瘤细胞杀伤增强疗效。