N4-乙酰胞苷增强合成mRNA的翻译产量与保真性

《Nature》：N4-Acetylcytidine enhances synthetic mRNA translation yield and fidelity

　　

合成mRNA治疗为癌症和感染性疾病等多种病症的治疗提供了一个高度灵活的平台。为了递送进入细胞，这些mRNA通常被封装于脂质纳米颗粒（LNP）中，并常常掺入修饰核糖核苷酸以提高稳定性、增强翻译并减轻免疫识别。N1-甲基假尿苷（m¹Ψ）因其在促进翻译和降低免疫原性方面的有效性，已成为合成mRNA的行业标准。然而，近期研究表明，m¹Ψ可能损害翻译保真性，导致过早终止和核糖体移码等错误。在此，研究人员揭示N4-乙酰胞苷（ac⁴C）是m¹Ψ的一种功能上不同的替代选择。在培养细胞系、原代人单核细胞来源树突状细胞以及小鼠肝脏中，ac⁴C在抑制炎症反应方面与m¹Ψ同样有效，同时驱动更高的蛋白产量。对翻译过程的单分子成像显示，ac⁴C修饰与m¹Ψ修饰转录本的每条mRNA核糖体密度总体相似。然而，m¹Ψ修饰mRNA的翻译延伸几乎比ac⁴C慢2倍，这导致蛋白输出降低，并增加核糖体碰撞，后者又通过激活质量控制通路和+1移码而进一步限制蛋白生成。这些发现强调了治疗性mRNA设计中“序列与功能语境”的重要性，并将翻译延伸速率定位为决定修饰核糖核苷酸效能的关键因素。

这篇发表于《Nature》的论文围绕合成mRNA治疗中“核苷修饰如何影响翻译效率与翻译准确性”这一核心问题展开。当前体外转录（IVT）mRNA已成为重要的治疗平台，典型应用包括mRNA疫苗和蛋白替代治疗。为了提升稳定性、降低先天免疫识别并增强蛋白表达，研究与产业界广泛采用修饰核苷，其中N1-甲基假尿苷（m¹Ψ）已成为主流标准。然而，已有研究提示，m¹Ψ虽然能够降低免疫原性，却可能带来翻译保真性下降的问题，包括过早终止、核糖体移码以及潜在新抗原（neoantigen）的产生。这意味着，单纯以蛋白表达量或免疫沉默效果评价修饰核苷并不充分，仍需寻找兼具高表达、低免疫刺激和高翻译准确性的替代方案。基于既往关于N4-乙酰胞苷（ac⁴C）的研究基础，研究人员系统比较了ac⁴C与m¹Ψ在多种细胞和体内环境中的功能差异，重点解析其对翻译延伸动力学、核糖体碰撞、核糖体相关质量控制（RQC，核糖体相关质量监控）以及移码的影响。研究表明，ac⁴C在抑制炎症反应方面与m¹Ψ相当，但可实现更高蛋白产量和更优翻译保真性；机制上，关键差异不在核糖体装载多少，而在于核糖体沿修饰mRNA延伸的速度与是否发生碰撞。论文的重要意义在于，将治疗性mRNA优化的关注重点从“起始与免疫逃逸”扩展到“延伸动力学与保真性控制”，提出翻译延伸速率是评价修饰核苷功能的关键决定因素。

研究人员采用的主要技术方法包括：构建不同核苷修饰的IVT mRNA，并在HeLa细胞、THP-1来源M0巨噬细胞、原代人单核细胞来源树突状细胞（MoDCs，样本来自美国国立卫生研究院健康供体外周血）、小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）及BALB/c小鼠肝脏中进行比较；结合LNP递送、电转、兔网织红细胞裂解液（RRL）无细胞翻译体系、RT–qPCR、免疫印迹、流式细胞术与活体发光检测评估表达和免疫反应；利用单分子新生肽成像（SINAPs）、smFISH–IF、TIRF显微成像和ribosome runoff分析翻译动力学；通过ZNF598招募实验检测核糖体碰撞及RQC；并以Ribo-seq、RNA-seq和质谱分析评估核糖体停滞、移码和翻译产物特征。

以下按论文主体结果小标题进行解读。

ac⁴C enhances IVT mRNA translation

研究人员首先构建了以NanoLuc为报告基因的IVT mRNA，分别引入ac⁴C、m⁵C、Ψ和m¹Ψ修饰，并通过设计无C的5′非翻译区（UTR）将ac⁴C限制在编码区（CDS）内，以避免其对翻译起始的不利影响。在HeLa细胞中，经LNP递送后，各组mRNA递送效率和衰减动力学总体可比，修饰mRNA半衰期均优于未修饰对照，但ac⁴C修饰mRNA在RNA水平并未增加的情况下产生了最高的NanoLuc蛋白表达。由于HeLa细胞中IFNB1和p-eIF2α诱导很弱，说明这一优势并不能简单归因于免疫抑制。进一步采用可减少双链RNA（dsRNA）副产物的G47A+884G突变T7聚合酶制备mRNA后，ac⁴C的翻译优势仍然存在，提示其具有独立于dsRNA诱导免疫效应的内在促翻译作用。

为排除内吞逃逸效率差异的干扰，研究人员又采用电转方式将mRNA直接送入细胞质。尽管m¹Ψ修饰mRNA在电转后显示更高进入效率，ac⁴C仍能在按mRNA水平归一化后表现出更强的蛋白输出，且这一效应不被m⁵C复制，双修饰mRNA则翻译较差。随后在RRL无细胞体系中，ac⁴C修饰mRNA持续支持蛋白累积而无明显平台期，进一步证明其增强翻译并非依赖递送方式或细胞免疫通路，而是作用于翻译本身。研究人员还使用经密码子优化的NanoLuc开放阅读框及膜蛋白CD25进行验证，结果显示ac⁴C对不同编码背景和膜蛋白表达同样具有优势；在长时间暴露条件下，其递送水平与m¹Ψ相近，但单细胞蛋白表达强度持续更高，说明ac⁴C提高的是每个细胞的蛋白产出能力。

ac⁴C reduces immune responses to IVT mRNA

在治疗相关环境中，研究人员进一步考察ac⁴C对免疫激活的影响。在THP-1来源M0巨噬细胞和原代人MoDCs中，未修饰mRNA显著诱导IFNB1、TNF及eIF2α磷酸化，而ac⁴C与m¹Ψ均可明显抑制这些反应，且ac⁴C总体上维持或略优于m¹Ψ的免疫沉默效果。尽管两者免疫抑制相近，ac⁴C仍 consistently 产生更高NanoLuc蛋白，说明其翻译优势并不依赖更强的免疫抑制。

为进一步区分免疫效应与翻译效应，研究人员采用两种策略削弱dsRNA信号：一是PKR药理抑制，二是采用突变T7聚合酶减少dsRNA副产物。两种条件下，ac⁴C相对m¹Ψ的蛋白表达优势均得以保留。此外，在MoDCs中通过mRNA剂量滴定，研究人员找到一个既可产生较强蛋白表达又不诱导IFNB1的低剂量条件，在该“亚免疫刺激”剂量下，ac⁴C相对m¹Ψ的翻译优势反而更明显。这些结果明确表明，ac⁴C抑制先天免疫和增强翻译是机制上可分离的两个过程。

关于免疫抑制机制，研究人员注意到尿苷修饰常通过降低RNase T2介导的切割，减少激活TLR7/TLR8的富尿苷片段生成。体外切割实验显示，ac⁴C与m¹Ψ对RNase T2均表现出相似抗性，而m⁵C敏感性居中。这提示尽管ac⁴C修饰的是胞苷而非尿苷，但其与m¹Ψ在免疫抑制上的相似性，很可能收敛于对RNA加工与受体激活前体生成的共同影响。进一步在BALB/c小鼠体内静脉递送LNP封装NanoLuc mRNA后，ac⁴C在24 h时使肝脏发光约增加3.5倍，且这种差异不能由LNP性质或递送量差异解释；在MEFs中也得到类似结果。由此，ac⁴C在原代细胞和体内环境中同样兼具低免疫刺激和高蛋白输出特征。

Modifications increase ribosome density

为了从单分子层面分析翻译，研究人员采用SINAPs系统对进入胞质的单条mRNA进行成像。该系统通过SunTag标记新生肽、MS2位点标记mRNA，从而同时观察转录本和其翻译位点（TLS）。固定细胞smFISH–IF分析显示，与未修饰和m⁵C修饰相比，ac⁴C和m¹Ψ修饰mRNA被翻译的比例更高，每条正在翻译的mRNA负载的新生肽数也更多，说明两种修饰均增强了核糖体参与度。时间序列分析进一步表明，ac⁴C并未通过显著改善内体逃逸来获得优势，因为其胞质mRNA数量、翻译参与度与m¹Ψ总体相近。多聚核糖体分级分析也支持修饰mRNA较未修饰mRNA更富集于重多聚核糖体，而m¹Ψ富集最强。

然而，这一结果带来了一个关键矛盾：在总体实验中ac⁴C蛋白产量更高，但单分子和多聚核糖体数据却显示m¹Ψ往往具有更高核糖体占据。由此，研究人员认识到，决定最终蛋白产量的并不仅是“有多少核糖体上了mRNA”，而更可能是“这些核糖体沿mRNA前进得有多快、是否顺畅”。

m¹Ψ slows elongation and induces RQC

为直接测量翻译延伸动力学，研究人员在活细胞中实施ribosome runoff实验。加入harringtonine阻断新的翻译起始后，已在延伸中的核糖体继续前行并最终离开mRNA，翻译位点消失时间可反映延伸速率。结果显示，未修饰mRNA和m⁵C修饰mRNA清除最快，ac⁴C居中，而m¹Ψ最慢；其中m¹Ψ修饰mRNA的中位runoff时间约为13.7 min，而ac⁴C约为6.7 min，提示前者延伸显著减慢，接近后者的2倍。由此可以解释为何m¹Ψ尽管核糖体占据较高，却蛋白产量偏低：核糖体是在“堆积”，而非高效产出。

研究人员随后检测核糖体碰撞和RQC激活。ZNF598是识别并泛素化碰撞核糖体的E3连接酶。活细胞成像显示，约三分之二的m¹Ψ修饰转录本与ZNF598发生共定位，而未修饰和ac⁴C修饰mRNA仅约三分之一；同时，m¹Ψ上的ZNF598信号强度约增加2倍，说明碰撞更频繁且持续更久。进一步敲低ZNF598后，m¹Ψ修饰mRNA的runoff时间进一步延长，而ac⁴C几乎不受影响，直接证明m¹Ψ更易触发碰撞依赖性的RQC。论文据此指出，m¹Ψ导致的慢延伸会引发核糖体交通堵塞，继而通过新生肽降解及可能的起始反馈抑制进一步降低功能性蛋白输出。

Enhanced translation fidelity with ac⁴C

在翻译准确性方面，研究人员构建了N端Flag标记的萤火虫荧光素酶（FLuc）移码报告系统，包括含5×U序列或5×C序列的野生型和+1移码报告体。若发生+1移码，则+1FS报告体可翻译出全长FLuc；若未移码，则主要产生N端截短产物。RNA-seq证实各条件转录错误率可比，排除了模板差异干扰。

在RRL体系中，m¹Ψ修饰的+1FS-5×U报告体产生了显著的全长FLuc，而ac⁴C、m⁵C和未修饰转录本几乎无此信号；将m¹Ψ引入双修饰mRNA又可恢复移码，说明该效应是m¹Ψ内在属性。对于5×C背景，ac⁴C并未增加移码。HeLa细胞转染实验重复了上述结果：m¹Ψ在U富集序列中引起明显+1移码，而ac⁴C基本维持背景水平。由此可见，ac⁴C虽较未修饰mRNA略微减慢延伸，但不足以引发碰撞驱动的移码错误。

为了将这些现象与核糖体行为直接对应，研究人员在转染WT-5×U FLuc mRNA的HeLa细胞中进行了核糖体测序（Ribo-seq）。结果显示，未修饰与ac⁴C修饰FLuc的核糖体保护片段（RPF）沿编码区分布相近，并未观察到明显停滞；相反，m¹Ψ修饰FLuc在下游一段富U区域发生显著核糖体积聚，并出现相隔约31 nt的P位点富集峰，符合堆叠或碰撞核糖体特征。该区域尿苷含量高于全CDS平均水平，提示m¹Ψ在富U序列中可能造成局部速度失配与停顿。质谱分析未在优化编码背景中广泛检出5×U位点移码肽，但在脯氨酸富集的C-rich区域，于m¹Ψ和未修饰FLuc中检测到低水平+1移码肽，而ac⁴C中未见，提示ac⁴C可能因增强Watson–Crick配对而在易发生P位点滑移的序列中具有保真性优势。

论文讨论部分围绕“翻译延伸动力学决定修饰核苷功能输出”这一中心观点展开。研究人员提出“modified position braking（BUMP）”模型，即修饰核苷在mRNA上造成局部延伸减速，从而影响后续核糖体流动。未修饰mRNA延伸快，但易诱导p-eIF2α，限制起始；ac⁴C使延伸适度减慢，却避免碰撞敏感的核糖体堆叠，因此兼顾效率与准确性；m¹Ψ则使延伸过度减慢，促进碰撞、RQC和+1移码。研究还指出，两种修饰在分子层面的差异可能源于其在核糖体解码中心的不同作用：ac⁴C通过稳定与鸟苷的Watson–Crick配对促进解码，而m¹Ψ在P位点构象上更不利，增加停留时间。论文同时强调，治疗性mRNA设计不能仅依据免疫逃逸和核糖体装载评估，还需关注延伸速度、碰撞倾向与翻译保真性。

研究结论部分可译为：本研究确立了，合成mRNA的功能输出不仅取决于核糖体是否装载到转录本上，还取决于核糖体沿修饰转录本行进的生产性与准确性。研究人员提出，翻译性BUMP，即由核苷酸修饰引入的核糖体流动局部扰动，可作为理解RNA化学变化如何被翻译机器解读的统一框架。将这一原则纳入mRNA设计，有望促进下一代治疗性mRNA在多种应用场景中获得更优性能。