低眼巨鲶（Pangasius bocourti）鱼鳔酶解肽的制备及其降血糖活性

《Food Science & Nutrition》：Preparation and Hypoglycemic Activity of Enzymatically Hydrolyzed Peptides From the Swim Bladder of Pangasius bocourti

　　

低眼巨鲶（Pangasius bocourti）鱼鳔是一种蛋白质含量高但未被充分利用的渔业副产物，然而其作为降血糖肽来源的潜力尚未得到系统性研究。该研究旨在通过整合酶解工艺优化、肽组学分析及体内评价，制备并表征源自低眼巨鲶鱼鳔（PBSB）的生物活性肽。研究人员比较评估了五种作法儿蛋白酶，基于水解度（DH）和α-葡萄糖苷酶抑制活性，碱性蛋白酶（Alkaline Protease）被确定为最优酶种。在优化条件下（pH 9.5，酶添加量2%，50°C，4 h），所得肽（PBSBPs）表现出显著的α-葡萄糖苷酶抑制活性（5 mg/mL时抑制率为67.90% ± 0.26%）。纳米液相色谱-串联质谱（Nano-LC–MS/MS）分析鉴定出101条肽段，其中91.09%的分子量低于1500 Da。这些肽段序列富含疏水性和降血糖相关氨基酸残基，58条肽被预测具有α-葡萄糖苷酶抑制潜力。此外，PBSBPs显著改善了糖尿病小鼠的葡萄糖耐量，降低了血清甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平，并缓解了肝脏脂质蓄积和胰岛损伤。该研究整合了工艺优化、肽谱表征与生物学验证，为水产生物副产物中功能肽的开发提供了系统性策略。这些发现凸显了PBSBPs作为天然抗糖尿病功能配料的应用潜力，并促进了渔业加工副产物的高值化利用。

该研究聚焦于糖尿病（Diabetes Mellitus）这一全球性慢性代谢性疾病，其并发症包括视网膜病变、神经病变和肾病等，严重威胁人类健康与生活品质。据预测，2021至2045年间全球20-79岁人群糖尿病患病率将从10.5%升至12.2%，医疗支出持续攀升。尽管二甲双胍（Metformin）和胰岛素等降糖药物已广泛应用于临床，但长期使用伴随胃肠道副作用、低血糖风险及高昂经济负担等问题。因此，从天然资源中开发安全、有效且可持续的降糖制剂日益受到关注。

食物源生物活性肽因高生物相容性、多样生物活性及相对低毒性，成为糖调节领域的 promising 候选物。研究表明，生物活性肽可通过抑制碳水化合物水解酶如α-淀粉酶（α-Amylase）、α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase）及二肽基肽酶-IV（DPP-IV）等多种机制调控葡萄糖代谢，部分肽还具有抗氧化和抗炎活性，有助于缓解糖尿病并发症。在诸多制备策略中，酶解法因反应条件温和、特异性高、环境友好且能产生多样化活性肽序列而被广泛采用。

鱼鳔作为富含胶原蛋白、低脂肪的蛋白质资源，是生物活性肽的潜在来源。低眼巨鲶（Pangasius bocourti）是东南亚广泛养殖的重要淡水经济鱼类，占全球淡水养殖及加工产业的重要地位。由于其高鱼片产率（约40%）、快速生长及良好加工特性，低眼巨鲶已成为大规模水产食品加工和国际贸易的重要原料。然而，工业化加工产生大量副产物，包括鱼头、内脏、骨骼、鱼皮和鱼鳔等，其中副产物可占鱼体总质量的58.80%，导致蛋白质资源的严重未充分利用。鱼鳔作为胶原蛋白丰富的组织，具有制备功能肽的良好潜力，但源自低眼巨鲶鱼鳔的肽的制备、肽表征及降血糖活性尚未得到系统性研究。

因此，该研究旨在优化低眼巨鲶鱼鳔生物活性肽的酶解制备条件，评价其体外α-葡萄糖苷酶抑制活性；采用纳米液相色谱-串联质谱（Nano-LC–MS/MS）表征肽组成，利用PeptideRanker和BIOPEP数据库预测已鉴定肽的降血糖潜力；并通过糖尿病小鼠模型评价PBSBPs的体内降血糖效应，为水产生物副产物中天然降血糖肽的开发提供理论基础。

该研究用到的主要关键技术方法包括：以广西北海宽利水产品有限公司提供的低眼巨鲶鱼鳔为原料，采用五种商业蛋白酶（碱性蛋白酶、风味蛋白酶、动物蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶）进行筛选；基于pH-stat法测定水解度（DH）；采用对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）为底物的微孔板法测定α-葡萄糖苷酶抑制活性；通过单因素实验结合L9（3⁴）正交实验设计优化酶解工艺；利用UltiMate 3000 RSLCnano系统结合Q Exactive质谱仪进行Nano-LC–MS/MS肽段鉴定；通过PeptideRanker和BIOPEP-UWM数据库进行生物活性预测；以C57BL/6小鼠（广东药康生物科技有限公司，许可证号：SCXK（粤）2020-0054）为实验动物，采用高脂饲料（60%脂肪供能，D12492，Research Diets）喂养12周建立2型糖尿病模型，设置正常对照组（NC）、模型组（Model）及低（50 mg/kg/d）、中（100 mg/kg/d）、高（200 mg/kg/d）三个PBSBPs剂量组进行灌胃干预4周；通过口服葡萄糖耐量试验（OGTT）评价葡萄糖耐量，采用迈瑞BS-240Vet兽用生化分析仪检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平；通过苏木精-伊红（H&E）染色进行肝脏、附睾脂肪组织和胰腺的组织病理学分析。

**蛋白酶筛选与水解度及抑制活性的关系**

研究人员比较了五种蛋白酶对PBSB的水解效果。碱性蛋白酶的水解度最高，其水解产物的α-葡萄糖苷酶抑制活性也最强，这与丝氨酸蛋白酶广泛的底物特异性和多样化切割位点特征有关。值得注意的是，高水解度并不总对应强抑制活性，木瓜蛋白酶处理组虽水解度最低，但其抑制活性高于风味蛋白酶，提示肽的生物活性不仅取决于水解程度，还与肽序列组成和结构特征密切相关。基于此，碱性蛋白酶被选为后续工艺优化的最优酶种。

**单因素实验**

温度、pH、时间、酶添加量和固液比均显著影响水解度和α-葡萄糖苷酶抑制活性。温度升高至55°C时两指标达最大值，超过后下降，这与温度对酶活性的双重影响有关。pH 10.5时两者最优，偏离此pH显著降低，pH不仅影响酶活性，还可能影响底物构象、蛋白酶切割特异性及肽序列稳定性。水解4 h时抑制率最高，延长反而下降，提示过度水解可能降解活性肽序列。酶添加量3%时抑制率最高，过量导致过度水解。固液比1:40（g/mL）时效果最佳，过高液体体积降低底物浓度和反应驱动力。

**正交实验结果**

以α-葡萄糖苷酶抑制率为评价指标，四因素三水平正交实验结果表明，各因素影响顺序为：pH > 酶添加量 > 水解时间 > 水解温度，pH影响最大，温度影响最小。最优组合为A1B1C2D1，即温度50°C、pH 9.5、时间4 h、酶添加量2%，此条件下PBSBPs在5 mg/mL时α-葡萄糖苷酶抑制率达67.90% ± 0.26%，较筛选阶段进一步提升，证明适宜水解条件对活性肽生成与保留的关键作用。

**肽活性及理化性质分析**

研究人员采用Nano-LC–MS/MS鉴定PBSBPs中的肽组分以探究其降血糖活性的结构基础。共鉴定出101条肽序列，大多数PeptideRanker评分高于0.5，表明具有相当生物活性潜力。91.09%的肽分子量低于1500 Da，这与碱性蛋白酶优先产生小肽片段的广泛底物特异性一致。低分子量肽更易接近α-葡萄糖苷酶活性位点，且可能具有更好的胃肠道稳定性。鉴定肽富含亮氨酸（L）、缬氨酸（V）、苯丙氨酸（F）、脯氨酸（P）、丙氨酸（A）和精氨酸（R）等疏水和支链氨基酸残基，这些残基常见于具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的肽中。19条肽C末端含丙氨酸，可能有助于抑制活性。BIOPEP-UWM数据库预测58条肽具有潜在α-葡萄糖苷酶抑制活性，如GAPGPSGPPGPA和GAAGPPGPVGPG。这些富含疏水氨基酸残基的低分子量肽可能与α-葡萄糖苷酶催化位点周围的疏水区域相互作用，从而产生抑制活性。

**PBSBPs对小鼠葡萄糖耐量的影响**

研究人员通过OGTT评估了PBSBPs的体内降血糖效应。模型组小鼠餐后120 min血糖水平显著高于正常对照组，表明葡萄糖耐量受损，这可能与胰岛素抵抗导致的肝脏、肌肉和脂肪组织胰岛素敏感性降低有关。PBSBPs低、中、高剂量组的OGTT曲线下面积（AUC）较模型组分别降低3.79%、7.55%和9.02%，表明PBSBPs改善了糖尿病小鼠的葡萄糖耐量。这种改善可能与其体外α-葡萄糖苷酶抑制活性相关，即通过延缓肠道碳水化合物消化和葡萄糖吸收，降低餐后血糖波动，减轻胰岛β细胞代谢负担。

**PBSBPs对血脂谱的影响**

模型组TG、TC和LDL-C水平显著高于正常对照组，呈现典型2型糖尿病血脂异常特征。所有PBSBPs处理组的TG、TC和LDL-C水平均低于模型组，高剂量组改善最为显著。同时，模型组HDL-C水平显著低于正常对照组，而PBSBPs处理组HDL-C随剂量增加逐步提高。这些结果表明PBSBPs可改善糖尿病小鼠血脂谱，可能通过调节糖脂代谢稳态降低糖尿病相关代谢并发症风险。

**H&E染色组织学分析**

正常对照组肝细胞形态正常，无脂质滴空泡；模型组肝细胞形态紊乱，胞内充满大小不等的脂质滴空泡，提示肝脏脂肪变性。PBSBPs干预后，肝脏脂质滴空泡数量显著减少，表明其可能缓解糖尿病小鼠肝脏脂质蓄积和脂肪变性。正常对照组附睾脂肪细胞形态正常，模型组脂肪细胞明显肥大；PBSBPs处理组脂肪细胞体积较模型组显著减小，提示PBSBPs可能通过缓解脂肪细胞肥大改善代谢状态。此外，模型组胰岛出现形态不规则、边界模糊等病理改变，PBSBPs处理后胰岛形态更规则、边界更清晰。这些结果综合表明PBSBPs能够减少肝脏脂质蓄积、缓解脂肪细胞肥大并改善胰岛形态，对糖尿病相关代谢紊乱具有有益作用。

该研究通过整合工艺优化、肽谱表征与生物学验证，系统阐明了低眼巨鲶鱼鳔酶解肽的制备及其降血糖活性。碱性蛋白酶在实验条件下产生最优水解产物，优化条件为温度50°C、pH 9.5、时间4 h、酶添加量2%（w/w）。PBSBPs在5 mg/mL时α-葡萄糖苷酶抑制率达67.90% ± 0.26%，具有显著体外抑制活性。Nano-LC–MS/MS鉴定101条肽，91.09%分子量低于1500 Da，BIOPEP-UWM预测58条肽具潜在α-葡萄糖苷酶抑制活性。体内实验证实PBSBPs显著改善葡萄糖耐量和血脂谱，缓解肝脏脂肪变性、附睾脂肪细胞肥大及胰岛损伤。该研究仍存局限：已鉴定肽的结构-活性关系尚未系统阐明；其胃肠道稳定性、生物利用度及精确分子作用机制仍不清楚。未来研究应聚焦于：系统性结构-活性关系分析；消化稳定性和生物利用度评价；分子和细胞水平的机制研究；动物模型中长期安全性和有效性评估。解决这些问题将促进PBSBPs作为天然降糖功能配料的开发，并推动水产加工副产物的可持续高值化利用。