《Food Science & Nutrition》：Bioactivity Assessment and In Silico Target Engagement of Clerodendrum infortunatum Extracts: Correlating Experimental Outcomes With DFT and Docking Predictions
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大青（*ClerTM infortunatum*，唇形科）在传统医学中常用于治疗炎症、发热、疼痛及胃肠道疾病。尽管其应用广泛，但支持这些治疗声称的科学证据有限，且对其活性植物化学成分的研究尚不充分。本研究旨在通过整合体内（in vivo）和计算机模拟（in s
大青（*ClerTM infortunatum*，唇形科）在传统医学中常用于治疗炎症、发热、疼痛及胃肠道疾病。尽管其应用广泛，但支持这些治疗声称的科学证据有限，且对其活性植物化学成分的研究尚不充分。本研究旨在通过整合体内（in vivo）和计算机模拟（in silico）方法，考察大青叶甲醇提取物（MECI）及其正己烷组分（NHF）的抗炎、镇痛、解热和止泻活性。抗炎活性通过蛋白质变性试验和角叉菜胶诱导足肿胀模型进行评价；镇痛效应通过醋酸扭体试验和尾浸试验评估；解热和止泻活性分别通过酵母诱导发热模型和蓖麻油诱导腹泻模型进行考察。此外，研究人员还进行了分子对接、ADME/T（吸收、分布、代谢、排泄/毒性）、密度泛函理论（DFT）和PASS（物质活性谱预测）分析，以探索已鉴定化合物的药代动力学特征和潜在分子靶点。MECI显示出强效的蛋白质变性抑制作用（89.29%），其半数抑制浓度（IC??）为44.10 μg/mL，与双氯芬酸钠相当。MECI和NHF均能以剂量依赖性方式显著减轻角叉菜胶诱导的足肿胀和扭体反应（p < 0.001），延长尾浸试验中的潜伏期，并有效降低酵母诱导的发热和蓖麻油诱导的腹泻。计算机模拟分子对接显示，烃基肉桂酸衍生物（hydrocinnamic acid, o-[(1,2,3,4-tetrahydro-2-naphthyl)methyl]-）对环氧化酶-2（COX-2）和M3毒蕈碱受体具有高结合亲和力（分别为?9.1和?10.2 kcal/mol），而乙基异别胆酸盐（ethyl isoallocholate）对微粒体前列腺素E合酶-1（mPGES-1）表现出显著亲和力（?5.6 kcal/mol）。ADME/T、DFT和PASS预测表明主要组分具有良好的口服生物利用度和低毒性。研究结果证实了大青的传统药用价値，证明其通过COX-2、mPGES-1和M3毒蕈碱受体通路介导的多靶点药理作用。烃基肉桂酸衍生物和乙基异别胆酸盐作为新型抗炎、镇痛和解热治疗药物的开发候选化合物展现出良好前景。
疼痛与炎症是机体对损伤、刺激物或病原体产生的免疫防御机制，可表现为疼痛、红肿、发热及功能障碍等症状。然而，持续性或失控性炎症可导致类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和缺血性心脏病等多种慢性疾病的发生。此外，感染性疾病（如结核、麻风、梅毒）和非感染性疾病（如哮喘、腹膜炎、炎症性肠病、血管炎、肾炎、乳糜泻及其他自身免疫性疾病）也常伴有疼痛和炎症症状。甾体和非甾体抗炎药（NSAIDs）虽常用于缓解上述症状，但长期使用可能对肾脏、肝脏、胃肠道、心血管系统、中枢神经系统和肺等器官产生不良反应。因此，尽管镇痛抗炎药物种类繁多，开发疗效更佳、副作用更少的新药仍具迫切需求。药用植物是最具前景的发现来源之一，因其富含生物活性植物化学成分。
在威胁生命的疾病中，腹泻仍是全球重大公共卫生问题，尤其在发展中国家。2017年，腹泻约占五岁以下儿童死亡原因的8%，是该年龄组第二大死因。腹泻可由多种细菌、病毒和寄生虫感染引起。在欧洲和北美等发达地区，病毒感染（常呈明显冬季季节性）是腹泻病例的主要原因；而在卫生条件差、卫生习惯有限的发展中国家，肠道寄生虫感染更为普遍，且往往在夏季达到高峰。目前，腹泻治疗主要通过使用减缓胃肠道转运的药物，常用药物包括洛哌丁胺、地芬诺酯、可待因和稀释阿片酊剂。然而，研究表明，用止泻药治疗胃肠炎后常发生肝脓肿；洛哌丁胺的常见副作用还包括便秘、呕吐、嗜睡和头晕。
发热被定义为体温超过正常生理范围的有调节性升高。平均正常口腔体温为36.7°C至37°C，直肠温度通常高约0.6°C，腋温则低约0.6°C。发热是机体对感染性或非感染性免疫挑战的复杂适应性反应。
生物学研究人员正日益利用计算生物学为验证研究结果创造重要机遇。计算机模拟筛选可有效预测植物化学物质的药理活性。计算机辅助药物设计（CADD）技术，包括分子对接，已在相对短时间内证明了对药物候选物研究和开发的价値。有效的分子对接分析应准确定位配体在结合位点的位置，并阐明蛋白质结构内的物理化学相互作用。
大青（*Clerodendrum infortunatum* Linn.，马鞭草科）是一种陆生灌木，具方形深色茎和简单对生十字排列的叶片。叶片具柄、无托叶、革质、被毛，植株散发特殊不良气味。大青的不同部位在当地传统医学中用于治疗绞痛、蝎蜇、蛇咬伤、肿瘤和某些皮肤病；在民间医学中也用于管理支气管炎、哮喘、发热、血液疾病、炎症、灼热感和癫痫。植物化学分析显示其含有三萜、甾体和类黄酮等生物活性化合物。该植物报告的抗氧化、抗菌、驱虫和镇痛特性引起了相当大的研究兴趣。
基于上述背景，研究人员系统评价了大青叶甲醇提取物（MECI）及其正己烷组分（NHF）的抗炎、镇痛、止泻和解热活性，并进行了计算机模拟分子对接和ADMET分析，以探索潜在作用机制并评估生物活性化合物的药代动力学和毒理学特性。
该研究采用的关键技术方法包括：体内实验采用瑞士白化雄性小鼠（4–5周龄，体重25–35 g，来源于贾汉吉尔纳加尔大学动物房），分组给药后分别进行蛋白质变性试验、角叉菜胶诱导足肿胀试验、醋酸扭体试验、尾浸试验、蓖麻油诱导腹泻试验和啤酒酵母诱导发热试验；计算机模拟部分包括：通过SwissADME和pkCSM进行ADME/T预测，从PubChem数据库获取配体三维结构并经Open Babel和AutoDock Tools处理后用于分子对接，从RCSB蛋白质数据库获取人环氧化酶-2（PDB: 5IKR）、M3毒蕈碱乙酰胆碱受体（PDB: 5ZHP）和微粒体前列腺素E合酶-1（PDB: 4YK5）的晶体结构，使用PyRx AutoDock Vina进行分子对接，采用PyRx虚拟筛选工具中MMFF94力场进行蛋白质结构能量最小化，通过B3LYP/6-31G密度泛函理论方法进行前线分子轨道.krbitals（FMO）分析和全局反应性描述符计算，以及利用PASS在线服务器进行生物活性预测。
研究结果部分按以下小标题展开：
蛋白质变性试验：通过鸡蛋清蛋白变性试验评价MECI的抗炎潜力。在500 μg/mL浓度下，MECI表现出89.29%的蛋白质变性抑制率，与双氯芬酸钠（91.76%）相当；其IC??值为44.10 μg/mL，显著低于双氯芬酸钠（78.18 μg/mL），表明该提取物具有强效抗炎活性。
角叉菜胶诱导足肿胀：通过角叉菜胶诱导足肿胀模型评估MECI和NHF的体内抗炎活性。标准药双氯芬酸钠从第2小时起显著抑制足肿胀（p < 0.001），在4小时达峰。MECI 400 mg/kg从第2小时起显著抑制足肿胀，第3小时和24小时效果持续显著（p < 0.001）。NHF也显示出明显的足围减小，尤其在24小时后。各组最大抗炎效应均出现在24小时时间点，表明存在时间依赖性和进行性炎症抑制。
醋酸扭体试验：通过醋酸扭体法评估镇痛活性。MECI以剂量依赖性方式显著减少扭体次数，200和400 mg/kg剂量分别产生52.63%和61.47%的抑制率，与双氯芬酸钠（73.30%）相当。NHF 400 mg/kg也显示出显著的抗伤害感受活性，抑制率达63.34%。
尾浸试验：通过尾浸试验评价中枢镇痛活性。MECI在200和400 mg/kg剂量下于30和60分钟时显著延长反应时间（p < 0.001）。NHF 400 mg/kg在120分钟时表现出最显著效果（p < 0.001）。反应时间延长百分比随时间逐渐增加。
蓖麻油诱导腹泻：通过蓖麻油诱导腹泻模型评价止泻活性。MECI 400 mg/kg表现出轻度止泻效果，而NHF 400 mg/kg显著减少腹泻频率，较对照组降低35.29%（标准药洛哌丁胺为45.09%）。
啤酒酵母诱导发热：通过啤酒酵母诱导发热法评价解热活性。MECI和NHF以剂量依赖性方式显著降低酵母诱导的高热，效果在给药后4小时内保持显著。400 mg/kg剂量下，MECI和NHF分别实现96.22%和98.18%的退热效果。
ADME/T分析：通过Lipinski五规则、SwissADME和pkCSM评估15种化合物的ADME特性。所有化合物均符合Lipinski五规则，适合口服给药。大多数化合物预测为非致突变性（AMES阴性）和非肝毒性；少数化合物（如烃基肉桂酸衍生物、2-十四酰基泛硫醇）可能显示肝毒性。
分子对接研究：将化合物与四种相关靶蛋白进行分子对接以评价潜在药理活性。针对抗炎和镇痛活性，化合物与环氧化酶-2（PDB: 5IKR）对接，其中烃基肉桂酸衍生物显示出最高结合亲和力（?9.0 kcal/mol），优于参考药双氯芬酸钠（?8.1 kcal/mol）。针对止泻活性，与M3毒蕈碱受体（PDB: 5ZHP）对接，同一烃基肉桂酸衍生物以?10.2 kcal/mol的最高亲和力结合，超过洛哌丁胺（?8.5 kcal/mol）。针对解热活性，与微粒体前列腺素E合酶-1（mPGES-1）（PDB: 4YK5）对接，乙基异别胆酸盐表现出最高结合亲和力（?5.6 kcal/mol）。
前线分子轨道评价：对分子对接中排名前两位的化合物进行密度泛函理论分析。结果表明，烃基肉桂酸具有更高的最高占据分子轨道（HOMO）能量（?0.22945 au）和更低的最低未占分子轨道（LUMO）能量（?0.01255 au），其HOMO–LUMO能隙更小（0.2169 au），全局软度更高（8.26446 au?1），亲电指数更大（0.067501 au），表明其化学活性更高、与生物靶标的相互作用潜力更有利、生物利用度可能更佳。相比之下，乙基异别胆酸盐能隙更宽，反应性描述符较低。
PASS预测：通过PASS在线服务器对15种生理活性化学物质进行抗炎、镇痛、止泻和解热效果筛选。结果显示多数化合物具有相应的活性概率。
讨论部分，研究人员首先指出MECI和NHF表现出显著的抗炎、镇痛、解热和止泻活性，与大青在传统医学中长期用于管理炎症性疾病、疼痛、发热和胃肠功能紊乱的用途高度一致。这些生物活性可能源于提取物中多种植物化学物质的协同作用，包括烃基肉桂酸衍生物、脂肪酸酯、植物甾醇和三萜类化合物。
抗炎方面，MECI在蛋白质变性试验中抑制率达89.29%，接近双氯芬酸钠，且IC??更低，表明其对蛋白质完整性具有强保护作用。角叉菜胶诱导足肿胀试验中，MECI和NHF均剂量依赖性显著抑制足肿胀，高剂量在24小时效果最显著，提示其可能通过干扰前列腺素合成、特别是抑制环氧化酶（COX）发挥作用。分子对接结果支持这一机制：烃基肉桂酸衍生物对COX-2具有高结合亲和力（?9.0 kcal/mol），与关键残基形成稳定相互作用，优于双氯芬酸钠。
镇痛方面，醋酸扭体试验中MECI和NHF剂量依赖性减少扭体，最高抑制率接近双氯芬酸钠，反映外周镇痛作用；尾浸试验中反应潜伏期显著增加，表明存在中枢神经系统介导的镇痛。这种外周和中枢双重镇痛成分指向双机制作用，与其他大青属物种报道的双镇痛谱一致。
解热方面，啤酒酵母诱导发热模型中两种提取物均有效降低体温，400 mg/kg剂量在4小时内使体温正常化率达96%–98%。该发热由脑内PGE?合成介导，通过COX和mPGES-1激活实现。计算机模拟分析中，乙基异别胆酸盐对mPGES-1显示强结合（?5.6 kcal/mol），与对乙酰氨基酚机制相似。
止泻方面，蓖麻油诱导腹泻模型中提取物显示中等但统计学显著的止泻效果。蓖麻油代谢为蓖麻油酸后刺激前列腺素释放，增强肠液分泌和蠕动。止泻作用可能涉及抑制前列腺素驱动的过度分泌和/或调节胆碱能信号。分子对接揭示烃基肉桂酸衍生物与M3毒蕈碱受体的强结合（?10.2 kcal/mol），甚至优于洛哌丁胺，提示涉及前列腺素抑制和毒蕈碱受体拮抗的双重机制。
前沿分子轨道分析为理解分子电子结构、反应性和相互作用潜力提供了基础洞见。窄的HOMO–LUMO能隙通常意味着增强的化学反应性。在该DFT研究中，烃基肉桂酸衍生物表现出有利的电子特征，提示改善的生物利用度；而乙基异别胆酸盐则显示不同的轨道构型，可能有利于氧化还原活性应用。
药代动力学分析显示所有主要组分符合Lipinski五规则，具有良好的口服生物利用度。烃基肉桂酸衍生物和乙基异别胆酸盐表现出高肠道吸收率（>95%），且在Ames试验中无肝毒性和致突变性迹象。
研究人员认为，观察到的药理效应源于多化合物、多靶点相互作用，这是许多传统草药的标志。体内发现支持外周和中枢双重作用机制，计算机模拟分析则 pinpoint COX-2、mPGES-1和M3毒蕈碱受体为关键分子靶点——这些蛋白质在炎症、疼痛、发热和胃肠道运动调节中起关键作用。这种多药理学特征可能比单靶点合成药物更具治疗优势，通过同时调节相互关联的病理生理网络，以更有效地应对复杂疾病的多元因素，并可能降低代偿性耐药机制的风险。
研究同时也 acknowledge 了局限性：分子对接采用蛋白质刚性、配体柔性的标准假设，未考虑配体结合时蛋白质的诱导-fit构象变化；体内实验样本量较小（每组n=5）；使用粗提物而非纯化合物，无法确定确切的活性物质；计算机模拟结果需进一步生化分子实验验证；仅使用雄性小鼠，性别差异可能影响结果；未进行全面的毒理学评估。未来研究应优先考虑生物活性引导的分馏、详细的受体结合和功能实验，以及全面的临床前安全性和毒性研究。
研究结论如下：本研究为MECI和NHF具有显著抗炎、镇痛、解热和止泻活性提供了强有力证据，这些效应通过外周和中枢机制介导，可能通过抑制前列腺素合成和调节COX-2、mPGES-1和M3毒蕈碱受体等关键靶点实现。分子对接证实了生物活性化合物对这些靶点的强结合，ADME/T和PASS预测进一步支持其药物样特性、低毒性和高口服生物利用度。研究结果证实了大青的传统用途，并突出其植物化学成分作为天然治疗药物开发先导化合物的潜力。未来工作应聚焦于化合物分离、详细机制研究和植物药的临床前开发。
