《Materials Today Bio》：PROTAC-based nanoassemblies targeting BRD4 for potentiate FLASH radiosensitization therapy
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超高剂量率放疗(FLASH-RT, Ultrahigh dose-rate radiotherapy)是一种能改善正常组织保护的新型放疗模式，但肿瘤放射抵抗仍限制其临床应用。为此，研究人员开发了由叶酸偶联PEG2000–ARV-771(FA-PEG2000-A
超高剂量率放疗(FLASH-RT, Ultrahigh dose-rate radiotherapy)是一种能改善正常组织保护的新型放疗模式，但肿瘤放射抵抗仍限制其临床应用。为此，研究人员开发了由叶酸偶联PEG2000–ARV-771(FA-PEG2000-ARV-771)自组装形成的新型还原响应型PROTAC(Proteolysis-Targeting Chimera, 蛋白水解靶向嵌合体)纳米平台(APF)。经叶酸(folate, FA)介导靶向及肿瘤细胞胞吞后，APF纳米粒在还原性肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中谷胱甘肽(glutathione, GSH)触发断裂，释放ARV-771促进溴结构域蛋白4(BRD4, bromodomain-containing protein 4)的蛋白酶体降解。BRD4降低破坏BRD4-c-Myc-RAD51AP1信号轴并使DNA修复通路受损，从而在花瓣加速器(Petal Accelerator)平台上对FLASH放疗产生显著增敏效应。体外(in vitro)与体内(in vivo)实验均表明，APF辅助FLASH-RT明显诱导肿瘤细胞凋亡与坏死，有效抑制肿瘤恶性进展。此外，APF通过促进细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成并加剧DNA双链断裂(double-strand breaks, DSBs)，进一步增强FLASH-RT的杀伤作用。转录组分析显示APF介导的BRD4降解下调关键DNA修复相关基因。最终APF@FLASH-RT联合治疗在体内获得优异抑瘤效果且全身毒性极低。本工作通过靶向蛋白降解为增强FLASH放疗疗效提供了一种前景广阔的纳米药物策略。
研究背景与意义
传统放疗(radiotherapy, RT)是局限性实体恶性肿瘤的核心治疗手段，但其治疗窗较窄，剂量提升会损伤邻近正常组织器官。超高剂量率放疗即FLASH放疗(FLASH-RT)，以＞40 Gy/s的极快照射速度对肿瘤靶区实施照射，可在保持与传统放疗相当抑瘤效果的同时显著缩短照射时间、减轻正常组织不良反应，是极具前景的新兴放疗技术。然而，部分肿瘤存在固有放射抵抗(radioresistance)，其典型机制为同源重组(homologous recombination, HR)因子如RAD51和RAD51AP1代偿性上调，加速照射后DNA损伤修复(DNA damage repair, DDR)，削弱放射敏感性。溴结构域蛋白4(BRD4, bromodomain-containing protein 4)作为调控肿瘤转录与DNA修复的关键分子，是理想的放射增敏靶点。传统小分子BRD4抑制剂存在靶点阻断不完全、蛋白代偿性累积等局限，影响增敏潜力。蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC, Proteolysis-Targeting Chimera)技术可利用泛素-蛋白酶体系统实现目标蛋白不可逆降解而非单纯功能抑制，但PROTAC分子疏水性强、药代动力学差，且缺乏肿瘤特异性递送易导致脱靶毒性。因此，开发具肿瘤特异性的高效低毒PROTAC递送体系以增强FLASH放疗敏感性是亟待解决的难题。本研究由徐瑞玲(Ruiling Xu)、杨志(Zhi Yang)等发表于《Materials Today Bio》，研究人员构建还原响应型叶酸靶向PROTAC纳米组装体APF，证实其通过降解BRD4阻断BRD4-c-Myc-RAD51AP1轴抑制DNA修复、并促进FLASH-RT诱导的ROS与DNA双链断裂，在体内外显著提升FLASH放疗抑瘤效果且安全性良好，为克服肿瘤放射抵抗、提升FLASH放疗治疗指数提供了纳米医学新策略。
主要关键技术方法
研究人员以人宫颈癌HeLa细胞及BALB/c裸鼠皮下HeLa移植瘤模型为研究对象，开展以下关键实验：(1)合成叶酸偶联PEG2000–ARV-771(FA-PEG2000-ARV-771)并通过纳米沉淀法自组装制备还原响应型APF纳米粒，进行形貌(TEM)、粒径(DLS)、稳定性及GSH触发释药表征；(2)采用CCK-8检测细胞活力，DiD标记结合共聚焦与流式细胞术分析细胞摄取，免疫荧光与Western blot验证BRD4经蛋白酶体依赖途径降解；(3)以花瓣加速器(8 MeV电子模式，平均剂量率94 Gy·s-?1)实施FLASH放疗(FRT, 6 Gy体外/10 Gy体内)，通过活死细胞染色、克隆形成、划痕、Annexin V-FITC/7-AAD凋亡检测、DCFH-DA探针测ROS、γ-H2AX免疫荧光评估DNA损伤评价体外放射增敏；(4)活体荧光成像分析Cy5.5标记APF的肿瘤靶向分布，荷瘤小鼠分组(对照、APF、FRT、APF@FRT)治疗并监测肿瘤体积、取瘤行γ-H2AX/TUNEL/Ki-67免疫荧光、血生化与主要脏器H&E评估体内疗效与生物安全性；(5)RNA测序(RNA-seq)分析差异表达基因(DEGs)并行GO/KEGG富集与基因互作网络分析；(6)免疫荧光与Western blot检测BRD4、c-Myc、RAD51AP1及p21在细胞与组织中的表达变化验证作用机制。
研究结果
3.1. Preparation and Characterization of APF(APF的制备与表征)
TEM显示APF呈规整球形，DLS测得流体力学直径约146.7 nm，多分散指数(PDI)0.074，在SBF、PBS及含10% FBS的DMEM中粒径72 h内基本稳定；在含10 mM GSH的PBS中48 h ARV-771累积释放率达72.6%，无GSH时仅10.6%，证实还原响应释药特性。CCK-8显示APF浓度3 μg/mL对HeLa细胞有明显毒性而对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)影响甚微，体现叶酸受体(FR)介导摄取与GSH触发释药的 selectivity。DiD@APF在HeLa细胞中摄取呈时间依赖性，5 h积累高于2 h。MG132(蛋白酶体抑制剂)或MLN4924(needdylation抑制剂)可逆转APF引起的BRD4下调，证明BRD4降低依赖蛋白酶体降解途径。
3.2. Radiosensitization of APF in vitro(APF体外放射增敏作用)
活死细胞染色显示APF@FRT组死细胞(红色PI荧光)显著多于单药或单放组；克隆形成实验表明APF@FRT对集落形成抑制最强；划痕实验示APF@FRT组24 h迁移率(约43.74%)较对照组(约81.57%)减半；Annexin V-FITC/7-AAD检测APF@FRT诱导凋亡率最高，且体外DNA损伤为对照组的3.2倍，证实APF可有效增敏FLASH-RT。
3.3. APF enhanced radiotherapy-induced ROS accumulation and DNA damage(APF增强放疗诱导的ROS蓄积与DNA损伤)
DCFH-DA探针显示FRT即升高细胞内ROS绿色荧光，APF@FRT组平均荧光强度(MFI)较FRT组高1.36倍；γ-H2AX免疫荧光示APF@FRT组MFI较FRT组升高33.9%。表明APF通过放大辐射诱导ROS及加重DNA双链断裂增强FLASH-RT的细胞杀伤。
3.4. Augmentation the anti-tumor activity of FLASH-RT in vivo through the APF sensitization effect(APF增敏FLASH-RT增强体内抗肿瘤活性)
活体成像示Cy5.5@APF在肿瘤部位荧光强度为无叶酸靶向Cy5.5@AP组的2.5倍，证实叶酸介导肿瘤主动靶向。荷瘤小鼠治疗中APF@FRT组肿瘤生长抑制最显著，切除瘤重最轻；肿瘤切片γ-H2AX荧光最强、TUNEL阳性细胞最多、Ki-67荧光最低。血生化(ALT、AST、尿素、肌酐)与血常规均在正常范围，主要脏器H&E未见异常，体重平稳，表明联合治疗全身毒性可忽略。
3.5. Mechanism of APF nanoparticles enhancing anti-tumor effect of FLASH-RT(APF增强FLASH-RT抗肿瘤效应的机制)
RNA-seq显示FRT上调CDKN1A(p21)并代偿性上调RAD51AP1致适应性抵抗；APF单独处理下调细胞周期转换与DNA结合转录因子结合等生物学过程。APF@FRT广泛下调基因表达，显著下调MYC(BRD4下游靶基因)；KEGG富集示Wnt、PI3K–Akt、MAPK及多能干细胞调控通路被抑制；基因互作网络示MYC为核心节点连接多通路，证实APF@FRT破坏BRD4–c-Myc轴并抑制多条促癌通路。
3.6. APF sensitized HeLa tumor cells to RT via BRD4-c-Myc-RAD51AP1 degradation(APF通过BRD4-c-Myc-RAD51AP1降解使HeLa细胞对RT增敏)
免疫荧光与Western blot证实APF及APF@FRT组BRD4与c-Myc蛋白表达明显下降，FRT不影响BRD4水平；RAD51AP1荧光在APF处理后显著减弱。表明APF通过降解BRD4切断BRD4-c-Myc-RAD51AP1信号轴，抑制DNA修复相关因子表达从而增敏。
3.7. APF downregulated BRD4-c-Myc-RAD51AP1 and modulated p21 response to radiation in vivo(APF下调BRD4-c-Myc-RAD51AP1并调节体内辐射p21应答)
小鼠肿瘤组织免疫荧光示APF及APF@FRT组BRD4、c-Myc、RAD51AP1荧光信号较对照与FRT组明显减弱；FRT组p21(IHC)上调印证DNA损伤引发p21依赖细胞周期阻滞，APF@FRT部分缓解该阻滞，说明APF通过抑制BRD4-c-Myc-RAD51AP1轴干扰DNA修复进程、降低肿瘤细胞对FLASH-RT耐受。
讨论与结论翻译
研究人员在讨论中指出，FLASH-RT虽直接造成致死性DNA双链断裂，但可经p21依赖细胞周期阻滞驱动宫颈癌中RAD51AP1代偿上调引致适应性放射抵抗；所构建的还原响应靶向PROTAC纳米粒APF在肿瘤细胞内释放ARV-771降解BRD4，抑制RAD51AP1诱导并损害DNA修复动力学，从而增敏FLASH-RT。结论如下：综上，研究人员成功开发了还原响应型PROTAC纳米平台(APF)以增强FLASH放疗抗肿瘤疗效。该自组装纳米粒具良好稳定性及谷胱甘肽触发药物释放特性，可实现BRD4降解剂ARV-771的高效肿瘤递送。机制上，APF显著放大辐射诱导ROS产生并加剧DNA双链断裂，同时抑制BRD4-c-Myc-RAD51AP1通路、干扰DNA修复进程，从而产生显著FLASH放疗增敏效果。因此，APF@FLASH-RT联合治疗在体内取得优异抑瘤效果且几无全身毒性。本工作确立了通过选择性蛋白降解增强FLASH放疗效力的纳米医学策略，对提高治疗指数及克服放射抵抗具有重要意义。
