《Materials Today Bio》：Selection of a Novel MSC-Targeted Aptamer Pt-1 and its Functionalized Hydrogel for Tissue Regeneration
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基于间充质干细胞（MSC）的治疗为再生医学提供了重要机遇，然而，缺乏谱系特异性的精准细胞募集工具，仍然构成该领域的主要限制。在本研究中，研究人员利用细胞指数富集配体系统进化技术（Cell-SELEX），以人牙髓干细胞（hDPSCs）为靶细胞，开发出一种新型单链
基于间充质干细胞（MSC）的治疗为再生医学提供了重要机遇，然而，缺乏谱系特异性的精准细胞募集工具，仍然构成该领域的主要限制。在本研究中，研究人员利用细胞指数富集配体系统进化技术（Cell-SELEX），以人牙髓干细胞（hDPSCs）为靶细胞，开发出一种新型单链DNA（ssDNA）适配体，命名为Pt-1。Pt-1表现出较高的靶向特异性、较强的结合亲和力以及良好的生理稳定性。值得注意的是，Pt-1在异质性的牙髓干细胞（DPSCs）群体中识别出一个独特亚群；与Pt-1Low组相比，Pt-1high亚群显示出显著增强的增殖能力以及成骨/成牙本质分化潜能。通过蛋白质组学分析与分子对接，研究人员阐明Pt-1以Cav1相关靶标作为其膜表面靶点。为了将这种分子识别能力转化为再生策略，研究人员构建了Pt-1功能化的ChSMA水凝胶。与已有的Apt19S适配体相比，这种生物指令性支架在体外和体内均显示出更优越的内源性MSC归巢调控效能。在大鼠牙髓缺损与股骨骨缺损模型中，Pt-1修饰水凝胶显著加速了组织修复，促进了更加成熟的小梁骨形成以及牙髓组织再生。总之，本研究开发出一种靶向MSC的新型ssDNA适配体，并建立了一种基于适配体的精准内源性细胞募集策略，为再生医学开辟了新的治疗途径。
该文发表于《Materials Today Bio》，研究聚焦于再生医学中内源性干细胞精准募集工具匮乏这一关键瓶颈。当前干细胞治疗虽已广泛用于组织修复与细胞替代，但其临床转化仍受到多重限制，包括缺乏用于干细胞精准分离与表征的特异性生物标志物、外源细胞移植带来的免疫排斥和致瘤风险、体内命运实时追踪困难，以及原位修复过程中内源性干细胞募集效率不足。既往适配体研究虽提示核酸适配体在干细胞靶向、示踪和递送方面具有显著潜力，但现有代表性适配体多来源于胚胎干细胞或诱导多能干细胞（iPSCs），受伦理争议与多能性相关致瘤风险所限，临床外推价值有限。相比之下，成体来源的间充质干细胞（MSC）更安全、伦理可接受性更高，并在心脏、骨、肝及神经组织再生中展现出广泛应用前景。然而，MSC异质性强、体内分布不可预测、局部滞留率低，而MSC谱系特异性适配体仍然稀缺，因此开发面向MSC的精准分子识别工具具有迫切意义。
基于此，研究人员选择来源便利、具备多向分化潜能的人牙髓干细胞（hDPSCs）作为筛选靶细胞，采用细胞指数富集配体系统进化技术（Cell-SELEX）筛得新型单链DNA（ssDNA）适配体Pt-1，并围绕其结合特异性、亲和力、生物稳定性、跨MSC谱系识别能力、体内外示踪能力及膜表面靶标进行了系统评价。在机制层面，研究人员进一步结合蛋白质组学、拉下实验、阻断实验、表达调控与分子对接，确定Pt-1识别Caveolin-1（Cav1）相关靶标。随后，研究人员将Pt-1共价接枝至ChSMA水凝胶，构建具备生物指令性的功能化支架，验证其对内源性MSC归巢和组织修复的促进作用，并在牙髓再生和骨缺损修复动物模型中评估治疗效果。
研究结论表明，Pt-1是一种具有较高特异性、较强亲和力和良好稳定性的MSC靶向适配体，不仅能够在DPSC异质群体中识别出增殖及成骨/成牙本质分化潜能更强的Pt-1High亚群，还可作为内源性MSC募集和体内示踪的分子工具。进一步构建的Pt-1功能化ChSMA水凝胶在体外和体内均优于Apt19S功能化水凝胶，能够更有效促进MSC归巢，并显著增强牙髓与骨组织再生。该研究的重要意义在于，为MSC精准识别、亚群分选、靶向递送及原位组织工程提供了新的分子基础与技术策略，也为再生医学中“无细胞化”内源修复路径提供了有力支撑。
就主要技术方法而言，研究人员首先从20名供体的正畸拔除牙中分离hDPSCs，并进行流式细胞术与成骨/成脂诱导鉴定；随后利用Cell-SELEX筛选Pt-1，并通过流式细胞术、共聚焦显微镜、Kd测定、血清稳定性实验评估其性能。此后结合FACS分选、qRT-PCR、Western blot、蛋白质组学质谱（MS）、适配体拉下、抗体阻断、Cav1表达上调/下调及分子对接解析靶标机制。最后构建Pt-1@ChSMA水凝胶，并通过Transwell迁移、异位牙根段裸鼠植入、大鼠股骨缺损模型、Micro-CT及组织学染色评价其再生效应。
2.1. Screening of an aptamer specifically targeting dental pulp stem cells
研究人员首先从正畸拔除的前磨牙或第三磨牙牙髓组织中分离获得DPSCs，并通过形态学、流式表型和多向分化实验确认其MSC特征。随后以传代4–6代DPSCs作为靶细胞进行Cell-SELEX筛选，采用含45 nt随机区的ssDNA文库，经多轮富集后在第10轮出现明显荧光右移，第12与14轮趋于平台，提示高亲和序列已富集。对优势序列进行克隆测序、同源性及层次聚类分析后，选出Pt-1至Pt-11共11条候选适配体。流式亲和力验证显示，Pt-1对DPSCs具有最强结合能力，且显著优于经典干细胞适配体Apt19S。二级结构预测表明Pt-1呈典型三叶草样构象；其解离常数Kd为136±46 nM，并在α-MEM及人血清中72 h内保持良好稳定性。该部分结果说明，研究人员成功筛得一种新型hDPSC靶向ssDNA适配体Pt-1。
2.2. Comprehensive Evaluation of Pt-1: From Molecular Specificity to In Vivo Spatiotemporal Tracking
为系统评估Pt-1性能，研究人员首先比较其对靶细胞和非靶细胞的识别能力。共聚焦显微镜与流式细胞术结果显示，Pt-1可特异结合DPSCs，而在HEK293阴性对照中几乎无明显信号，且主要定位于细胞膜。温度变化对其结合能力影响较小，提示Pt-1在不同生理条件下构象较稳定。经proteinase K或胰蛋白酶预处理后，Pt-1结合显著下降，说明其靶点很可能是膜蛋白而非糖脂成分。进一步研究显示，Pt-1还能识别人牙周膜干细胞（hPDLSCs）、人羊膜干细胞（hAMSCs）、人脂肪来源干细胞（hADSCs）和人骨髓间充质干细胞（hBMSCs），提示其具备广谱MSC识别能力。利用量子点标记Pt-1对人牙髓组织进行原位定位发现，Pt-1标记细胞主要分布于成牙本质细胞层及根管周血管龛位，反映DPSCs在牙髓内具有空间异质性。Cy5标记Pt-1用于体内示踪后，尾静脉注射的标记DPSCs在小鼠体内早期广泛分布，后续主要聚集于肝和肺，表明Pt-1还可作为体内干细胞追踪探针。
2.3. Sorting and characteristics of Pt-1 high expression and Pt-1 low expression DPSCs
流式分析提示DPSC群体中Pt-1靶标表达存在明显异质性，研究人员据此分选出Pt-1High与Pt-1Low两个亚群。两类细胞均保持梭形形态并表达CD44、CD146等MSC标志，且不表达CD34、CD45，但Pt-1High亚群的CD146水平更高。功能实验表明，Pt-1High细胞在21 d成骨诱导后形成更多矿化结节，CCK-8结果也证实其增殖能力更强。分子层面，qRT-PCR与Western blot显示，Pt-1High组RUNX2、DSPP和DMP1等成骨/成牙本质分化相关标志物表达显著升高。该部分结果说明，Pt-1不仅是膜表面识别工具，还可用于区分功能更优的DPSC亚群，提示其识别的靶标与干性及谱系分化潜能密切相关。
2.4. Identification of the target of Pt-1 aptamer on DPSCs membrane
为明确Pt-1膜表面靶点，研究人员首先进行了竞争结合实验，证实Pt-1与Apt19S占据DPSC膜上不同表位。之后提取DPSC膜蛋白，利用适配体偶联磁珠进行靶蛋白捕获，SDS-PAGE银染在约20 kDa处出现特异条带。蛋白质谱（MS）分析将Caveolin-1（Cav1）鉴定为主要候选分子，适配体拉下实验进一步富集到Cav1。抗体阻断实验显示，识别胞外可及区域的Cav1抗体可降低Pt-1结合能力。进一步通过Cav1表达下调和上调实验发现，Pt-1结合水平分别随Cav1降低和升高而变化，证明Pt-1结合具有Cav1依赖性。分子对接则揭示，Pt-1与Cav1之间通过氢键和盐桥构成稳定界面。综合说明，Pt-1识别的是Cav1相关靶标，这一发现也为其区分DPSC高功能亚群提供了生物学解释。
2.5. Preparation, characterization, and evaluation of Pt-1 functionalized hydrogel for dental pulp regeneration
在明确Pt-1分子识别性质后，研究人员进一步将其转化为再生应用平台。通过AC-PEG-NHS介导的缩合反应，将带氨基修饰的Pt-1与ChSMA基质羧基共价连接，构建Pt-1功能化水凝胶。X射线光电子能谱（XPS）检测到Pt-1@ChSMA组特征性的P 2p峰，证实DNA磷酸二酯骨架成功接枝。宏观观察和扫描电镜显示各组水凝胶均成型良好，并保留互连微孔结构。活/死染色、CCK-8和凋亡实验表明，适配体修饰不影响细胞存活、增殖及凋亡，具有良好细胞相容性。Transwell迁移实验进一步证实，Pt-1功能化水凝胶能显著促进DPSC定向迁移。在裸鼠异位牙根段植入模型中，Pt-1修饰水凝胶可在根管内募集更多宿主MSC样细胞，表明其具备促进牙髓再生所需的内源细胞归巢能力。
2.6. Engineering and Physicochemical Characterization of Pt-1 Functionalized Hydrogels for Bone Regeneration
鉴于Pt-1对多种MSC均有识别能力，研究人员进一步将其应用于骨再生。首先比较Pt-1与Apt19S对大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）的结合能力，流式结果显示Pt-1显著更强。随后制备ChSMA、Apt19S@ChSMA和Pt-1@ChSMA水凝胶。扫描电镜显示三组均保留互连微孔结构；琼脂糖凝胶电泳证实DNA组分稳定整合于水凝胶中。压缩模量测试提示适配体接枝未削弱支架力学性能，孔径、孔隙率及溶胀行为亦基本保持稳定。该部分说明，Pt-1引入并未破坏ChSMA支架关键理化性质，同时其对rBMSCs的高亲和力为后续骨缺损内源细胞募集奠定基础。
2.7. Evaluation of Cytocompatibility and MSC Recruitment Efficacy of Aptamer functionalized hydrogel In Vitro
在体外生物学评价中，研究人员再次确认三类水凝胶均具有良好细胞相容性。Calcein AM/PI活死染色显示各组以绿色活细胞为主；CCK-8证明细胞在支架内保持良好生长动力学；鬼笔环肽染色显示DPSCs在不同水凝胶中均维持梭形铺展形态。随后通过Transwell迁移实验评估趋化募集能力，结果显示裸ChSMA组细胞迁移最少，Pt-1@ChSMA组募集MSC数量显著高于Apt19S@ChSMA组，体现出MSC谱系特异筛选策略在竞争性募集环境中的优势。成骨诱导21 d后，茜素红S染色证实三组均可形成矿化结节，说明适配体修饰未削弱细胞固有成骨潜能。
2.8. In vivo bone defect repair facilitated by the aptamer functionalized hydrogel
在SD大鼠股骨缺损模型中，研究人员将ChSMA、Apt19S@ChSMA和Pt-1@ChSMA分别植入骨缺损部位，于术后3周和6周评价修复效果。Micro-CT显示，3周时Blank组和裸ChSMA组仍存在明显骨缺损，而两种适配体功能化组已出现更快骨形成和结构桥接。骨形态计量分析进一步表明，3周时Pt-1@ChSMA组在骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数（Tb.N）及骨小梁间距（Tb.Sp）等指标上优于其他组；6周时其BV/TV与骨小梁厚度（Tb.Th）仍保持显著优势。H&E及Masson染色证实，Pt-1@ChSMA组形成了更加成熟、有序的小梁骨并伴随致密胶原沉积，而对照组主要见纤维组织填充。与此同时，主要脏器H&E染色及肝、心、肾功能指标未见异常，炎症因子IL-6和TNF-α维持低基线水平，提示该体系具有良好体内安全性。该部分结果表明，Pt-1功能化水凝胶在体内骨修复中优于Apt19S功能化支架，其优势来源于对MSC更精准、更高效的募集。
讨论部分表明，本研究的核心创新在于以成体MSC谱系中的hDPSCs为直接筛选靶标，获得了区别于多能干细胞来源适配体的新型MSC靶向分子Pt-1。与Apt19S相比，Pt-1更能反映MSC特有的膜分子图谱，因此在DPSC、hBMSCs及rBMSCs等多种间充质细胞中均表现出更强结合能力，并可在异质性DPSC群体中分辨出具有更高增殖和成骨/成牙本质分化潜能的亚群。研究还将Pt-1识别能力与Cav1相关靶标联系起来，为其功能分层提供了机制依据。进一步地，Pt-1被整合到ChSMA水凝胶后，不改变支架理化与生物相容性，却显著增强了内源性MSC募集能力，从而在牙髓及骨缺损修复中取得优于Apt19S的治疗效果。整体上，研究将“适配体筛选—靶标解析—功能支架构建—组织修复验证”串联为完整技术链条，体现了精准再生医学从分子识别到材料转化的逻辑闭环。
研究结论部分可译为：
总之，研究人员以hDPSCs为靶细胞，利用细胞指数富集配体系统进化技术（Cell-SELEX）成功鉴定出一种新型MSC特异性适配体Pt-1。该适配体在体内外均表现出良好的靶向特异性、较高的结合亲和力和稳健的稳定性，从而保证了其在多种生物医学应用中的可靠性。蛋白质组学与分子分析进一步阐明，Pt-1将Cav1相关靶标识别为其在DPSCs上的对应膜靶点。此外，研究人员开发了Pt-1功能化水凝胶，该水凝胶能够有效调控内源性干细胞募集，并显著加快牙髓和骨组织的再生。总体而言，本研究为干细胞生物学提供了有力的分子工具，并为原位组织工程与再生医学提供了一种生物指令性策略。
