燃料-维持耦合重编程线粒体稳态以促进周围神经再生

《Materials Today Bio》：Fuel–Maintenance Coupling Reprograms Mitochondrial Homeostasis to Enable Peripheral Nerve Regeneration

　　

周围神经再生常因以线粒体功能障碍和生物能量衰竭为特征的“代谢瓶颈”而停滞。尽管神经引导导管（NGCs）提供了结构支持，但大多数在代谢上不活跃，未能解决这种能量缺陷。本研究开发了一种燃料-维持耦合的代谢重编程策略来支持周围神经修复。研究人员设计了一种仿生神经引导导管，其包含一个排列有序的电纺聚己内酯（PCL）鞘，内部填充了一种可注射、可原位光交联的载有厚朴酚的壳聚糖-硫辛酸水凝胶（LA-CS@Mag）。在这个协同系统中，α-硫辛酸（LA）作为代谢燃料来恢复三磷酸腺苷（ATP）的产生，而厚朴酚（Mag）则作为线粒体质量控制器，促进线粒体自噬（mitophagy）相关的线粒体清除。在体外，LA-CS@Mag保护了大鼠许旺细胞（RSCs）免受氧化应激损伤，恢复了线粒体膜电位，减少了活性氧（ROS）积累，并改善了ATP的产生，同时激活了BNIP3/Parkin相关的线粒体自噬。此外，来自LA-CS@Mag处理的许旺细胞的条件培养基减少了M1型巨噬细胞极化，并促进了M2型修复表型，表明许旺细胞介导的免疫调节作用。在体内，植入LA-CS@Mag/PCL导管调节了巨噬细胞极化，抑制了过度的早期炎症反应，并促进了修复性免疫微环境。在大鼠坐骨神经缺损模型中，这种生物活性导管显著加速了轴突再生和髓鞘再生，防止了靶肌肉萎缩，并实现了与自体移植物相当的功能恢复。总之，本研究确定线粒体稳态为一个治疗靶点，并为下一代神经引导导管提供了一种代谢指导策略。

**研究背景与存在问题**
周围神经损伤（PNI）是临床上一个严峻的挑战，尽管显微外科技术有所进步，但仍常导致持续的功能障碍。自体神经移植被认为是临床金标准，但其应用受到供区并发症和组织稀缺的固有限制。因此，神经引导导管（NGCs）已成为有前景的替代方案。然而，大多数现有的NGCs主要侧重于提供结构引导或部分调节炎症和氧化微环境，而未能解决最终决定有效周围神经再生的内在代谢需求。越来越多的证据强调了能量代谢在周围神经再生中的核心重要性。损伤后，病变部位迅速演变为一个恶劣的微环境，其特征是过度的活性氧积累、受损的营养和氧气供应以及炎症介质释放，这些共同破坏了线粒体完整性和生物能量稳态。轴突延伸和髓鞘再生等关键再生过程需要大量的ATP产生。因此，受损的生物能量学造成了关键的代谢瓶颈，限制了内在的再生能力。损伤后，许旺细胞（SCs）经历广泛的表型重编程以清除髓鞘碎片并形成Büngner带，这对线粒体动力学和持续的ATP产生提出了巨大需求。因此，许旺细胞中的线粒体完整性是周围神经再生的关键决定因素。除了ATP产生，线粒体质量控制对于维持许旺细胞活力和再生能力也很重要。在这些质量控制过程中，线粒体自噬选择性清除受损的线粒体，有助于限制氧化应激。当这种选择性清除途径受损时，受损的线粒体积累并维持促炎微环境，使巨噬细胞极化偏向持续的M1样表型。尽管神经损伤后需要短暂的M1激活来进行碎片清除和早期修复，但长期或未解决的炎症会破坏再生免疫动力学并最终损害神经再生。尽管具有核心的生物学作用，但以线粒体自噬为中心的治疗策略很少被纳入神经引导导管的设计中。从生物材料的角度来看，最近的生物活性水凝胶已开始通过能量相关机制调节组织修复。然而，这些系统主要解决代谢底物补充或线粒体保护，而在神经引导导管中将代谢燃料供应与线粒体质量维持相结合的研究仍不充分。

**研究内容与结论**
针对上述问题，研究人员开发了一种用于周围神经修复的燃料-维持耦合策略，将代谢支持与线粒体质量控制相结合。研究设计了一种仿生神经引导导管，其包含一个排列有序的聚己内酯（PCL）鞘和一个管腔核心，核心填充了载有厚朴酚（Mag）的α-硫辛酸（LA）接枝壳聚糖水凝胶（LA-CS@Mag）。在这种协同设计中，LA作为代谢燃料来恢复线粒体ATP的产生，而Mag则作为线粒体质量控制器，促进线粒体自噬相关的受损细胞器清除、抑制炎症并稳定细胞生物能量学。研究人员假设，线粒体燃料供应和质量维持的协调整合对于重建促再生微环境至关重要。该研究论文发表于《Materials Today Bio》。

**关键技术方法**
研究人员采用了几项关键技术来构建和评估LA-CS@Mag/PCL导管。首先，通过EDC/NHS介导的酰胺偶联合成了壳聚糖-硫辛酸（LA-CS），并通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）和扫描电子显微镜（SEM）等表征其化学结构和微观形貌。其次，通过静电纺丝技术制备了具有排列纤维结构的PCL导管鞘层，并将优化浓度（2% w/v）的LA-CS@Mag水凝胶前体溶液注入管腔，在紫外光（UV）照射下原位交联形成复合导管。通过流变学、溶胀、降解和药物释放实验对水凝胶性能进行了系统筛选和评估。体外研究使用了大鼠许旺细胞（RSCs）和PC12细胞系，通过CCK-8、活/死染色、免疫荧光、线粒体膜电位（JC-1）和活性氧（DCFH-DA）检测、ATP含量测定以及透射电子显微镜（TEM）等技术，评估了材料的生物相容性、对细胞增殖、迁移、分化的影响，以及对线粒体功能和线粒体自噬的调控作用。体内研究则建立了大鼠10毫米坐骨神经缺损模型（样本队列来源：成年Sprague-Dawley大鼠），将动物随机分为PCL导管组、LA-CS/PCL导管组、LA-CS@Mag/PCL导管组和自体移植物组，通过步态分析、旷场实验、电生理学检测、组织学染色（如H&E、甲苯胺蓝、Masson三色染色）、免疫荧光/免疫组化以及透射电镜等手段，综合评价了神经再生、髓鞘形成、肌肉萎缩恢复、免疫微环境重塑以及全身生物相容性。

**研究结果**
**3.1. LA-CS水凝胶的合成与表征**
成功合成了LA-CS水凝胶，FTIR光谱证实了α-硫辛酸成功接枝到壳聚糖骨架上。SEM显示水凝胶具有相互连接的三维多孔结构，有利于细胞容纳和物质扩散。元素映射表明硫均匀分布在水凝胶基质中。

**3.2. LA-CS@Mag/PCL导管的制备与表征**
流变学分析表明，2% LA-CS水凝胶的储能模量约为200 Pa，提供了柔软且顺应性好的管腔基质。该配方在溶胀、降解和Mag释放方面表现出平衡的动力学特征。将50 μM Mag载入2% LA-CS水凝胶并注入排列的电纺PCL导管管腔，紫外光交联后形成完整的LA-CS@Mag/PCL复合导管。接触角测量显示，与原始PCL导管相比，LA-CS/PCL导管的管腔表面更亲水。力学测试表明，水凝胶填充提高了导管的拉伸和压缩性能。

**3.3. 体外生物相容性与增殖评估**
CCK-8实验表明，LA-CS提取物单独处理可显著增强许旺细胞（RSCs）的活力，而加入Mag进一步提高了RSCs活力。在PC12细胞中，含Mag的提取物显著促进了细胞增殖。活/死染色和细胞骨架染色证实，LA-CS/PCL和LA-CS@Mag/PCL导管提供了细胞相容性良好的微环境。

**3.4. 增强神经源性分化和许旺细胞迁移**
免疫荧光显示，与对照组和Mag组相比，LA-CS@Mag水凝胶显著增强了PC12细胞的神经突生长，并上调了神经元标志物Tuj1和NeuN的表达。同时，培养在复合水凝胶上的RSCs上调了Nestin和GFAP的表达，表明其向修复相关的激活表型转变。划痕愈合和Transwell实验表明，LA-CS@Mag处理显著增强了RSCs的迁移能力。

**3.5. 线粒体自噬相关的线粒体质量控制驱动代谢重编程**
在过氧化氢（H₂O₂）诱导的氧化应激下，Mag处理诱导了线粒体与溶酶体的显著共定位，表明线粒体自噬活性增强。这种促线粒体自噬反应可被线粒体分裂抑制剂Mdivi-1减弱。免疫荧光和蛋白质印迹分析显示，Mag显著上调了线粒体自噬和自噬相关蛋白（BNIP3、Parkin、LC3B、ATG5）的表达。功能上，LA-CS@Mag处理在氧化应激条件下最有效地恢复了RSCs的ATP水平、线粒体膜电位，并降低了细胞内ROS水平，这些保护作用可被Mdivi-1部分抵消。透射电镜观察显示，LA-CS@Mag处理的细胞线粒体超微结构得到较好保存。

**3.6. LA-CS@Mag促进免疫调节和再生微环境重塑**
将从LA-CS@Mag处理的RSCs收集的条件培养基应用于RAW264.7巨噬细胞，可减少CD86/iNOS阳性（M1样）巨噬细胞，增加CD206/Arg1阳性（M2样）巨噬细胞，表明其向修复表型转变，此效应可被Mdivi-1部分减弱。RNA测序分析显示，LA-CS@Mag处理与涉及免疫反应、细胞因子-细胞因子受体相互作用、铁离子稳态、血管发育等基因程序的协调转录重编程相关。

**3.7. 宏观观察与功能恢复评估**
在大鼠10毫米坐骨神经缺损模型中，植入LA-CS@Mag/PCL导管的大鼠在术后12周表现出进行性的功能改善。步态分析显示，LA-CS@Mag/PCL组的坐骨神经功能指数（SFI）显著优于PCL组和LA-CS/PCL组，接近自体移植物组。旷场实验表明，该组大鼠的总运动距离增加，中央区域活动时间延长，静止时间减少。电生理学评估显示，LA-CS@Mag/PCL组的神经传导速度（NCV）和远端复合肌肉动作电位（DCMAP）振幅显著更高。此外，该组大鼠患侧腓肠肌湿重比显著提高，表明有效防止了靶肌肉萎缩。

**3.8. 神经再生与再支配的组织学和超微结构评估**
术后12周，透射电镜显示，LA-CS@Mag/PCL组再生轴突的髓鞘更厚、更致密，其轴突平均直径、髓鞘厚度、有髓轴突密度均显著高于PCL和LA-CS/PCL组，G比值显著降低，表明高度的髓鞘再生。H&E和甲苯胺蓝染色显示该组再生神经纤维排列密集有序。免疫荧光染色证实了再生轴突标志物（NF200、Tuj1）和许旺细胞髓鞘标志物（S100、MBP）的强烈、平行排列信号。腓肠肌Masson三色染色显示该组肌肉纤维排列良好，胶原纤维面积减少。

**3.9. 体内线粒体自噬相关的炎症微环境重编程**
免疫组化分析显示，LA-CS@Mag/PCL导管在体内增强了自噬和线粒体自噬相关通路（LC3B、ATG5、Parkin、BNIP3）的激活，并伴随自噬接头蛋白p62的调节，此效应可被Mdivi-1减弱。在损伤后1周，LA-CS@Mag/PCL组的iNOS阳性（M1样）巨噬细胞比例显著低于PCL和LA-CS/PCL组。在损伤后4周，该组的CD206、CD163和Arg1阳性（M2样）巨噬细胞比例显著更高，同时IL-6阳性染色减少。这表明该导管可能通过促进线粒体自噬介导的线粒体来源的危险相关分子模式（mtDAMPs）清除，来重塑损伤后的早期免疫微环境。

**3.10. 体内生物相容性与全身安全性评估**
对主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的组织学检查显示，各组均未见明显病理变化，表明LA-CS@Mag/PCL导管植入在实验条件下未引起可检测的全身毒性。

**讨论与结论总结**
本研究开发了一种基于燃料-维持耦合策略的代谢指导性神经引导导管，以解决限制周围神经再生的代谢瓶颈。通过整合α-硫辛酸介导的代谢支持与厚朴酚相关的线粒体质量控制，LA-CS@Mag/PCL导管有效恢复了许旺细胞的线粒体生物能量学，减轻了氧化应激，并增强了线粒体自噬相关的线粒体稳态。此外，经LA-CS@Mag处理的许旺细胞通过旁分泌调节促进了巨噬细胞向修复表型极化，表明许旺细胞线粒体质量控制与免疫微环境重塑之间存在联系。在体内，这些协调的代谢和免疫调节效应转化为增强的轴突再生、髓鞘再生、靶肌肉保存以及接近自体移植物性能的功能恢复。总之，这项工作确定线粒体稳态为一个治疗靶点，并为设计下一代生物活性神经引导导管提供了一个代谢指导框架。