含有基于人参皂苷Rh2的多功能脂质体的pH响应性微凝胶重塑肠道环境以增强雷公藤红素对溃疡性结肠炎的治疗

《Materials Today Bio》：pH-responsive microgels containing multifunctional ginsenoside Rh2-based liposomes remodel intestinal environment to enhance celastrol therapy for ulcerative colitis

　　

溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）是一种与肠道黏膜屏障损伤、免疫反应异常和肠道菌群失调密切相关的慢性炎症性肠病。雷公藤红素（Celastrol, Cel）是一种天然三萜类化合物，在调节巨噬细胞极化和抑制炎症方面显示出巨大潜力。然而，其临床应用受到溶解性差和非特异性生物分布的限制。为解决这些问题，研究人员开发了一种新型药物递送系统。首先，通过用人参皂苷Rh₂（Ginsenoside Rh2）替代胆固醇，构建了功能性脂质体（Rh2-LPs@Cel）。该策略不仅减少了药物泄漏并增强了制剂稳定性，还赋予了载体固有的生物活性。随后，这些脂质体被壳聚糖-海藻酸钠包覆，形成用于结肠靶向递送的pH响应性微凝胶（M/Rh2-LPs@Cel）。实验结果表明，该微凝胶在口服给药后能将药物精确递送至结肠。它有效促进了巨噬细胞向抗炎表型极化，降低了促炎因子水平，重塑了肠道菌群多样性，提高了短链脂肪酸水平，并修复了肠上皮屏障，从而减轻了葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulfate Sodium, DSS）诱导的小鼠结肠病理损伤。值得注意的是，M/Rh2-LPs@Cel在体外和体内均未显示出明显的毒性。总之，这项工作提出了一种结合了高效药物递送、靶向释放和多重治疗效应的UC治疗策略，为天然生物活性化合物在炎症性肠病管理中的临床应用提供了有价值的基础。

**研究背景与问题**
溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性复发性炎症性肠病，全球发病率持续上升，对公共卫生系统构成重大挑战。其发病机制与免疫稳态失调密切相关，其中巨噬细胞极化失衡是疾病进展的关键驱动因素。在UC肠道微环境中，促炎M1型巨噬细胞过度激活，通过大量释放炎症因子加剧组织损伤，而具有修复能力的M2型巨噬细胞极化受损，阻碍了炎症消退机制。这种极化失衡不仅维持黏膜炎症，还破坏上皮屏障完整性和扰乱微生物平衡，形成“炎症-屏障损伤-菌群失调”的恶性循环。因此，调节巨噬细胞极化以实现抗炎效应、屏障修复和菌群重建，是中断UC进展的有前景策略。

天然产物雷公藤红素（Cel）因其独特的免疫调节能力而备受关注。研究表明，Cel不仅能通过抑制核因子κB（Nuclear Factor kappa-B, NF-κB）通路促进巨噬细胞向M2表型极化，还能通过调节短链脂肪酸（Short-Chain Fatty Acids, SCFAs）代谢增强肠道屏障功能，并抑制致病菌过度生长，从而多方位恢复肠道稳态。然而，其极差的水溶性和口服生物利用度（<20%），加之非靶向分布带来的潜在毒性，严重限制了其临床应用。为克服这些限制，开发对结肠炎症微环境响应的靶向递送系统，以实现药物在病变部位的精确蓄积，对推进Cel的临床转化至关重要。

脂质体（Liposomes, LPs）被广泛用作难溶性药物的高效递送载体，但其常规成分胆固醇（Cholesterol, CHO）在长期应用中存在潜在心血管副作用的担忧。基于“结构-功能”替代策略，本研究提出利用人参皂苷Rh₂（Rh2）替代CHO来构建新型功能化脂质体（Rh2-LPs）。这种替代的原理超越了单纯的结构相似性；Rh2是一种具有固有抗炎活性的甾体化合物，可作为“功能性药用辅料”。其糖基部分对炎症组织中活化的巨噬细胞表面显著过表达的葡萄糖转运蛋白-1（Glucose Transporter-1, GLUT-1）具有高亲和力。通过将Rh2整合到脂质双层中，研究人员设计了多功能Rh2-LPs@Cel。然而，作为一种纳米制剂，Rh2-LPs@Cel在口服给药时仍面临胃酸降解和在病变部位蓄积不足的挑战，需要外部保护性载体以确保其靶向递送至结肠病变部位。

**研究内容与主要方法**
本研究构建了一种新型“纳米在微米内”的级联递送系统。具体而言，通过静电喷雾技术制备了pH响应性保护壳，包封Rh2-LPs@Cel，得到最终构建体M/Rh2-LPs@Cel。该系统协同整合了微凝胶的pH触发释放能力和Rh2功能化脂质体的细胞靶向特异性。研究采用乙醇注入法制备Rh2-LPs@Cel，并用人参皂苷Rh₂替代胆固醇。随后，通过静电喷雾技术，使用壳聚糖（Chitosan, CS）和海藻酸钠（Sodium Alginate, SA）包覆脂质体形成微凝胶。研究利用透射电子显微镜、动态光散射、傅里叶变换红外光谱、X射线衍射、差示扫描量热法等对制剂进行了表征。体外释放实验模拟了胃肠道pH环境。细胞实验使用小鼠巨噬细胞RAW264.7，通过脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）诱导建立炎症模型，评估了细胞摄取、细胞毒性、巨噬细胞极化调节和抗炎活性。体内研究使用雄性C57BL/6小鼠，通过饮用水中添加3% DSS构建UC模型，评估了M/Rh2-LPs@Cel的体内分布、治疗效果（包括疾病活动指数、结肠长度、组织病理学、髓过氧化物酶活性、细胞因子表达、紧密连接蛋白表达）、肠道菌群组成（16S rRNA测序）和短链脂肪酸水平，并进行了生物安全性评估。

**研究结果**
1. **Rh2-LPs@Cel的表征与细胞摄取机制**：成功制备了Rh2-LPs@Cel，其粒径（153.9 ± 3.4 nm）小于CHO-LPs@Cel（167.7 ± 1.9 nm），zeta电位更负（-23.57 ± 0.33 mV），表现出更优的胶体稳定性，且药物泄漏率更低。细胞毒性实验表明，Rh2-LPs@Cel在Cel浓度低于100 ng/mL时细胞活力超过80%，且在较高浓度下比游离Cel表现出更强的耐受性。细胞摄取实验表明，LPS激活的M1型巨噬细胞对Rh2-LPs@FITC的摄取显著强于CHO-LPs@FITC，其平均荧光强度是后者的5倍。机制研究表明，这种高效摄取部分依赖于Rh2与GLUT-1的相互作用，分子对接证实Rh2与GLUT-1的结合亲和力显著强于CHO。此外，网格蛋白介导的内存作用和巨胞饮作用也参与了细胞摄取。
2. **Rh2-LPs@Cel调节巨噬细胞极化与体外抗炎活性**：免疫荧光和酶联免疫吸附测定结果显示，Rh2-LPs@Cel能最有效地抑制M1标记物CD86的表达，促进M2标记物CD206的表达，并显著降低促炎因子肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α）的分泌，提升抗炎因子白细胞介素-10（Interleukin-10, IL-10）的水平，表明其具有最强的体外抗炎活性。
3. **M/Rh2-LPs@Cel的构建与表征**：通过静电喷雾技术成功制备了M/Rh2-LPs@Cel微凝胶，粒径主要分布在250-450 μm，形态均匀。傅里叶变换红外光谱、X射线衍射和差示扫描量热法分析证实了微凝胶的成功形成及对Rh2-LPs@Cel的有效包封。微凝胶在pH 7.4的模拟结肠液中表现出显著的溶胀行为（溶胀率约4844%）和pH响应性药物释放特性，在模拟胃液（pH 1.2）中释放极少，在模拟结肠液中累积释放率可达64%，表明其具有结肠靶向潜力。
4. **M/Rh2-LPs@Cel的体内分布与治疗疗效**：体内成像实验显示，M/Rh2-LPs@DiR相较于Rh2-LPs@DiR，在结肠部位表现出更强的蓄积和更长的滞留时间。在DSS诱导的UC小鼠模型中，M/Rh2-LPs@Cel治疗组显示出最佳的疗效：体重下降最少，疾病活动指数最低，结肠长度最接近正常组。组织病理学分析显示，M/Rh2-LPs@Cel能有效减轻结肠黏膜损伤、炎症细胞浸润，并恢复隐窝结构，其组织病理学评分在所有治疗组中最低。髓过氧化物酶活性也显著降低。
5. **M/Rh2-LPs@Cel调节免疫、修复屏障并重塑菌群**：体内免疫荧光分析证实，M/Rh2-LPs@Cel能有效抑制结肠组织中CD86（M1）表达，促进CD206（M2）表达，并显著下调促炎因子（TNF-α, IL-6）的mRNA水平，上调IL-10水平。同时，M/Rh2-LPs@Cel能显著上调紧密连接蛋白（ZO-1和Occludin）的表达，修复受损的肠道屏障。16S rRNA测序分析表明，M/Rh2-LPs@Cel干预能重塑肠道菌群结构，使其β多样性更接近正常组，显著增加毛螺菌科（Lachnospiraceae）、拟杆菌科（Muribaculaceae）等有益菌的相对丰度，降低肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和埃希氏菌-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）的相对丰度。此外，M/Rh2-LPs@Cel还显著提高了盲肠内容物中丙酸、丁酸和异丁酸等短链脂肪酸的水平。
6. **生物安全性评估**：体外细胞毒性实验表明，空白载体在测试浓度范围内对巨噬细胞无明显毒性。体内安全性评估显示，M/Rh2-LPs@Cel治疗组小鼠的血清肝功能（谷丙转氨酶、谷草转氨酶）和肾功能（血尿素氮、肌酐）指标与正常对照组无显著差异，主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的组织病理学检查也未发现明显损伤，表明该递送系统具有良好的生物安全性。

**讨论与结论**
本研究通过构建功能化脂质体并将其封装于多糖基微凝胶中，开发了一种用于UC治疗的M/Rh2-LPs@Cel级联递送系统。与大多数现有系统主要局限于宏观物理屏障构建和pH触发位点特异性释放不同，该系统通过将脂质体膜中的惰性辅料CHO替换为生物活性成分Rh₂，赋予了脂质体双层功能性，使其能够通过Rh2-GLUT-1相互作用被活化的巨噬细胞选择性识别和高效内化，从而克服了细胞水平的递送障碍。外层的多糖基微凝胶则有效克服了口服给药的生物屏障，提供了胃保护并实现了结肠特异性的pH触发药物释放。

基于上述设计，M/Rh2-LPs@Cel在DSS诱导的结肠炎模型中显示出显著的治疗效果，通过促进抗炎巨噬细胞极化、抑制促炎细胞因子释放、恢复肠道菌群平衡、增加短链脂肪酸水平，从而促进肠道屏障修复。与近年报道的类似口服递送系统相比，该系统结合了多糖基微凝胶的pH响应性药物释放行为和天然产物来源的功能性载体的固有优势，不仅促进了药物在结肠的蓄积，还增强了制剂被活化巨噬细胞的摄取，且无需外源性靶向配体。此外，该治疗方案还表现出良好的生物安全性，提示其作为UC治疗口服递送平台的临床转化潜力。

总之，本研究开发的M/Rh2-LPs@Cel在Cel的口服递送治疗UC方面显示出相当大的潜力。然而，其临床转化仍面临几个关键挑战：静电喷雾技术的产量相对较低，限制了大规模应用；人体胃肠道环境复杂多变，需要在生理相关模型中验证微凝胶的稳定性；需要进行全面的长期毒理学评估以分析潜在的生物蓄积并确认系统的生物安全性。解决这些挑战对于该递送系统未来的成功临床应用至关重要。

**研究结论**：本研究构建了一种新型的“纳米在微米内”级联递送系统M/Rh2-LPs@Cel，用于溃疡性结肠炎的结肠靶向治疗。该系统通过人参皂苷Rh₂功能化脂质体增强对活化巨噬细胞的靶向摄取，并通过pH响应性微凝胶实现结肠特异性药物释放。体内外实验证实，M/Rh2-LPs@Cel能有效调节巨噬细胞极化、抑制炎症、修复肠道屏障、重塑菌群平衡并提高短链脂肪酸水平，从而显著缓解DSS诱导的小鼠结肠炎，且表现出良好的生物相容性。该工作为利用天然产物递送系统进行UC的精准治疗提供了新的见解和实验基础。